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单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性检测试剂盒(微量法)
单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/96样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

MDHAR催化MDHA还原生成AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。

半岛bd体育手机客户端 内容:

提取液:液体110ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体15ml×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入2 ml蒸馏水充分溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加入2.5 ml蒸馏水充分溶解。

试剂四:液体×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2ml试剂一充分溶解。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水

操作步骤:

一、粗酶液提取:

1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500-1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声超声破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后10000rpm,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

二、MDHAR测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃水浴锅中预热30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂

试剂名称(μL) 试剂二 试剂三 试剂四 试剂一 蒸馏水 上清液
空白管 20 20 20 120 20
测定管 20 20 20 120
20

迅速混匀后于340nm比色,记录30s和150s的吸光值,分别记为A1、A2,ΔA=A1-A2,得到△A测定,△A空白。

三、MDHAR 活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=0.804×(△A测定-△A空白)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/g鲜重) =[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/104cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

ε:NADH摩尔消光系数,6220L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;106:1mol=1×106μmol;V反总:反应体系总体积,0.2ml=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1 ml;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/ml,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量, g;T:反应时间,2min;细胞数量:万个。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/g鲜重)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/104cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.340×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

ε:NADH摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;106:1mol=1×106μmol;V反总:反应体系总体积,0.2ml=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1 ml;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/ml,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量, g;T:反应时间,2min;细胞数量:万个。

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