半岛bd体育手机客户端 介绍
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 MDHAR催化MDHA还原生成AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。 半岛bd体育手机客户端 内容: 提取液:液体110ml×1瓶,4℃保存。 试剂一:液体15ml×1瓶,4℃保存。 试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入2 ml蒸馏水充分溶解。 试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加入2.5 ml蒸馏水充分溶解。 试剂四:液体×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2ml试剂一充分溶解。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水 操作步骤: 一、粗酶液提取: 1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。 2、细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500-1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声超声破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后10000rpm,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。 二、MDHAR测定操作: 1.分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃水浴锅中预热30 min。 3.依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂
迅速混匀后于340nm比色,记录30s和150s的吸光值,分别记为A1、A2,ΔA=A1-A2,得到△A测定,△A空白。 三、MDHAR 活性计算: a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按蛋白浓度计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=0.804×(△A测定-△A空白)÷Cpr (2)按样本鲜重计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/g鲜重) =[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷W (3)按细胞数量计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/104cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量 ε:NADH摩尔消光系数,6220L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;106:1mol=1×106μmol;V反总:反应体系总体积,0.2ml=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1 ml;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/ml,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量, g;T:反应时间,2min;细胞数量:万个。 b.使用96孔板测定的计算公式如下:(1)按蛋白浓度计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷Cpr (2)按样本鲜重计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/g鲜重)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷W (3)按细胞数量计算 MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。 MDHAR (U/104cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.340×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量 ε:NADH摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;106:1mol=1×106μmol;V反总:反应体系总体积,0.2ml=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1 ml;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/ml,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量, g;T:反应时间,2min;细胞数量:万个。 |
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