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注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责直链淀粉的合成。 GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成ADP;进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADpH,其中NADpH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比,通过340nm下测定NADpH的增加量,可以计算GBSS活性。 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 半岛bd体育手机客户端 内容:
溶液的配制: 1.试剂四:临用前每支加入5ml试剂一。 2.试剂五:临用前每支加入10ml试剂一。 3.试剂六:临用前取1支加入208 μL双蒸水,充分溶解备用,用不完的试剂4℃保存。 4.试剂八:每支临用前加入溶解好的4ml试剂四。 5.反应液Ⅰ的配制:临用前在试剂二中加入14ml试剂一,缓慢加热,逐渐升温使其溶解,冷却后加入试剂三混合溶解,这样可以分两批配制并且测定。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤: 一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 称取约0.1g组织加入1ml提取液,冰浴中匀浆。10000g ,4℃离心10min,弃上清,在沉淀中加入1ml提取液充分混匀,置冰上待测。 二、测定步骤 1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2.在EP管中按顺序加入下列试剂
混匀后立即转移200μL至微量石英比色皿或96孔板中,340nm波长下记录初始吸光度A1和2min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。注意:试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。 三、GBSS活性计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下: 1.按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白在1ml反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。 GBSS活性(U/mg prot)= [ΔA÷(ε×d)×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清)÷T=43.2×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 2.按照样本质量计算 单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。 GBSS活性(U/g鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清)÷T= 43.2×ΔA÷W 。 V测:测量体积,0.26ml;V样:加入样本体积,0.1ml;V反总:反应体积,0.31ml;V上清:加入上清液体积,0.15ml;V提取:加入提取液体积,1ml;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×10-3ml/nmoL/cm;d:比色皿光径,1cm;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样品质量,g。 b.使用96孔板测定的计算公式如下: 1.按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。 GBSS活性(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清)÷T =72×ΔA÷Cpr。此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 2.按照样本质量计算 单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。 GBSS活性(U/g鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清)÷T=72×ΔA÷W。 V测:测量体积,0.26ml;V样:加入样本体积,0.1ml;V反总:反应体积,0.31ml;V上清:加入上清液体积,0.15ml;V提取:加入提取液体积,1ml;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×10-3ml/nmoL/cm;d:比色皿光径,0.6cm;T:反应时间,20min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样品质量,g。 |
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