果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bispHospHate aldolase，FBA)(EC 4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶，催化果�?,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛，广泛存在于动植物及微生物体内，在各种逆境胁迫下表现不同的响应、�/span>

果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生�?-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和�?磷酸甘油�?40nm处吸光值的变化可反映果�?,6-二磷酸醛缩酶活性的高低、�/span>

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测、�/span>

产品组成９�/strong>

试剂名称	规格	保存条件
提取液一	液体110ml×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
提取液二	液体110ml×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂一	液体10ml×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂事�/span>	粉剂×1瓵�/span>	-20ℂ�/span>
试剂丈�/span>	粉剂×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂囚�/span>	液体×1�?/span>	2-8ℂ�/span>
试剂亓�/span>	液体×1�?/span>	-20ℂ�/span>

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加�?ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融：�/span>

2.试剂三：临用前加�?ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融：�/span>

3.试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融：�/span>

4.试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度�?酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研�?匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰、�/span>

操作步骤 (仅供参�? ９�/strong>

一、样品处理理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文�?

①� FBA酶：

组织：按照组织质�?g)：提取液体积(ml)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1ml提取液一)充分冰浴匀浆，然后 8000g�?℃，离心 10min，取上清置于冰上待测、�/span>

细菌或细胞：按照细菌或细胞数�?10⁴�?：提取液体积(ml)� 500�?000�?的比�?建议 500万细胞加� 1ml提取液一)，冰浴超声波破碎细菌或细�?功率 300w，超� 3秒，间隔 7秒，总时� 3min)；然�?000g�?℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。液体：直接检测、�/span>

②胞浆和叶绿� FBA酶的分离９�/span>

(1)按照植物组织质量(g)：提取液体积(ml)� 1�?-10的比�?建议称取� 0.1g样本，加� 1ml提取液一)，手工快速研磨或匀浆，之后� 4℃，200g离心 5min：�/span>

(2)弃沉淀，取上清� 4℃，8000g离心 10min(离心时缓慢加速和降�?：�/span>

(3)取上清用于测定胞� FBA酶活性，取沉淀� 1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴�?00W，破� 3s，间� 7s，总时� 1min)，然� 4℃，8000g离心 10min，上清即为叶绿体� FBA酶活性、�/span>

建议测定�FBA酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中�FBA，则按照步骤②提取粗酶液、�/span>

二、测定步骣�/span>

1.分光光度�?酶标仪预� 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/span>

2.样本测定�?在微量石英比色皿/96� UV板中分别加入下列试剂)、�/span>

试剂名称(μL)	测定箠�/span>	空白箠�/span>
试剂一	100	100
试剂事�/span>	20	20
试剂丈�/span>	20	20
试剂囚�/span>	20	20
试剂亓�/span>	20	20
样本	20	-
蒸馏氳�/span>	-	20
充分混匀后于 340nm处测� 10s时的吸光� A1，迅速置� 37�?哺乳动物)� 25�?其他物种)水浴 5min(有控温功能的酶标仪可以将温度调至 37℃或�?5�?，拿出迅速擦干测� 310s时的吸光� A2，分别记� A1测定、A2测定� A1空白� A2空白，计算ΔA测定箠�A1测定-A2测定，ΔA空白箠�A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定�?ΔA空白管�?空白管只需� 1-2�?

注意：如果检测样本量大，可以将试剂一、二、三、四、五按照 5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)、�/span>

三�?strong>FBA含量计算

A、按微量石英比色皿计算：

(1)按蛋白浓度计箖�/span>

酶活单位定义：每 mg组织蛋白每分钟消� 1nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

FBA酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总�?V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计箖�/span>

酶活单位定义：每 g组织每分消� 1nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

FBA酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总�?W ×V样÷V样�?÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞或细菌数量计箖�/span>

酶活单位定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟消� 1nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

FBA酶活(U/10⁴cell)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总�?V样×细胞数量÷V样�?÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个)

(4)按液体体积计箖�/span>

酶活单位定义：每 ml液体每分钟消� 1nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

FBA酶活(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数�?.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径�?cm� V样：加入样本体积�?.1ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度� mg/ml，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g�?09：单位换算系数，1mol=109nmol、�/span>

B、按 96� UV板计算：

将上述公式中� d-1cm改为 d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可、�/span>

注意事项９�/strong>

1.若ΔA大于 0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数、�/span>

2.若是植物样本，建议在提取完成� 2h内检测完，如果样本量过大，建议分批提取、检测、�/span>

3.由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(� 0.5mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量、�/span>