Rab5 Pull-Down Activation Assay Kit

Cat. # 83701

Introduction

蛋白A/G琼脂糖拉下、�/span>最后用Anti-Rab5 Rabbit Polyclonal Antibody免疫印迹法检测沉淀的Rab5-GTP、�/span>

C.试剂盒组仵�/span>

1.抗rab5 - gtp小鼠单克隆抗�?Cat、�/span># 26911): 1�? 35 μL (1 mg/ml) PBS, pH 7.4，含50%甘油、�/span>该抗体特异性识别来自所有脊椎动物的Rab5-GTP、�/span>

2.蛋白质A/G琼脂�?猫、�/span># 30301):一个小�? 600 μL 50%的浆液、�/span>

3.5X分析/裂解缓冲�?Cat、�/span># 30302):一�? 30 mL 250 mM Tris-HCl, pH 8, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100、�/span>

4.抗rab5兔多克隆抗体(Cat、�/span># 21151): 1�? 50 μL (1 mg/mL) PBS, pH�?.4，含�?0%甘油、�/span>

5.100X GTPγS (Cat、�/span># 30303): 1�? 50 μl 10 mM，使�? μl GTPγS�?.5 mL细胞裂解液进行gtp标记、�/span>

6.100倍GDP (Cat、�/span># 30304):一个小�? 50 μl�?00 mM，使�? μl GDP用于GDP标记0.5 mL细胞裂解液、�/span>

7.hrp -山羊抗兔IgG(猫、�/span>#29002): 50 μL (0.4 mg/mL) PBS, pH�?.4，含50%甘油、�/span>

D.需要但未提供的材料

1.刺激和非刺激细胞裂解�?/span>

2.蛋白酶抑制剂

3.4°C管摇杆或激振器

4.0.5 M EDTA, pH 8.0

5.1.0 M MgCl2

6.减少2倍的SDS-PAGE样品缓冲涱�/span>

7.电泳和免疫印迹系绞�/span>

8.免疫印迹洗涤缓冲液，如TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)

9.免疫印迹阻断缓冲�?�?%脱脂干乳�?%牛血清白蛋白的TBST)

10.ECL检测试剁�/span>

E.示例结果

下图演示使用Rab5活化测定试剂盒所看到的示例结果、�/span>仅供参考、�/span>

Rab5激活实验、�/span>用GDP(左道)或GTPγS(右道)处理纯化的全长Rab5蛋白后进行免疫共沉淀、�/span>用抗rab5 - gtp单克隆抗�?Cat、�/span># 26911)、�/span>免疫印迹法检测抗rab5多克隆抗�?Cat、�/span>#、�/span>21151)、�/span>

试验过程

A.试剂制备

1X测定/裂解缓冲涱�混合5X原液(Cat、�/span># 30301)并在去离子水中稀释至1X、�/span>在使用前添加蛋白酶抑制剂，如1 mM PMSF�?0 μg/mL白细胞肽素或10 μg/mL抑肽酶、�/span>

B.样品制备

贴壁细胞

1.培养细胞(一�?0厘米的平板，�?07个细�?，约80-90%融合、�/span>根据需要用激活剂或抑制剂刺激细胞、�/span>

2.抽吸培养基，用冰冷的PBS冲洗两次、�/span>

3.完全去除最终PBS洗涤液，并将冰冷�?X测定/溶解缓冲�?参见试剂制备)添加到细胞中(�?0 cm组织培养�?.5-1 mL)、�/span>

4.将培养板放在冰上10-20分钟、�/span>

5.用刮板将电池从板上刮下来、�/span>

6.将裂解物转移到合适大小的试管中并置于冰上、�/span>

7.如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液、�/span>如果发生这种情况，则可将裂解物通过27?号注射器针头3-4次，以剪切基因组DNA、�/span>

8.通过�?2,000 x g�?℃离�?0分钟来清除裂解产物、�/span>

9.收集上清液并将样�?~1-2 mg总蛋�?储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存�?70℃以备日后使用、�/span>

贴壁细胞

1.培养细胞并根据需要用激活剂或抑制剂进行刺激、�/span>

2.进行细胞计数，然后通过离心将细胞制成颗粒、�/span>

3.抽吸培养基，用冰冷的PBS冲洗两次、�/span>

4.完全去除最终PBS洗涤并将冰冷�?X测定/溶解缓冲�?参见试剂制备)添加到细胞颗�?0.5-1 mL / 107个细�?、�/span>

5.通过反复移液溶解细胞、�/span>

6.将裂解物转移到合适大小的试管中，并将其置于冰上、�/span>

7.如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液、�/span>如果发生这种情况，则可将裂解物通过27?号注射器针头3-4次，以剪切基因组DNA、�/span>

8.通过�?2,000 x g�?℃离�?0分钟来清除裂解产物、�/span>

9.收集上清液并将样品储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存�?70°C以备日后使用、�/span>

C. GTPγS/GDP蛋白体外阳性和阴性对�?/span>

�?体内刺激细胞将激活约10%的Rab5，而体外负载GTPγS蛋白将激活近90%的Rab5、�/span>

1.�?.5 mL细胞提取�?�? μg纯化的Rab5蛋白)分入两个微离心管中、�/span>

2.每管加入20 μL 0.5 M EDTA(终浓�?0 mM)、�/span>

3.阳性对�?加入5 μL 100 X GTPγS (Cat;# 30302)�?*箠�/span>

4.阴性对�?加入5 μL 100 × GDP (Cat、�/span># 30304)连接�?*管、�/span>

5.在搅拌的情况下，�?0℃孵育两�?0分钟、�/span>

6.通过将管置于冰上并添�?2.5 μL 1 M MgCl2(最终浓度为60 mM)来停止加载、�/span>

D.活化G蛋白的亲和力沉淀

1.�?.5-1 mL细胞裂解�?�? mg总细胞蛋�?分拆至微离心管中、�/span>

2.�?X测定/溶解缓冲液将体积调整�? mL(参见试剂制备)、�/span>

3.加入1 μL抗rab5 - gtp抗体(Cat、�/span># 26911)、�/span>

4.制备蛋白A/G琼脂糖珠�?Cat、�/span># 30301)通过顶点或滴定重悬、�/span>

5.快速加�?0 μL重悬珠浆至上述管中、�/span>

6.�?℃下将管缓慢搅拌1小时、�/span>

7.通过5,000 x g离心1 min使珠粒成球、�/span>

8.抽吸并丢弃上清液(确保不要干扰或移除珠�?、�/span>

9.�?.5 mL 1X测定/裂解缓冲液洗�?次，每次离心并抽吸、�/span>

10.在第三次洗涤后，通过离心使珠粒成球并小心地去除所有上清液、�/span>

11.�?0 μL 2X还原SDS- PAGE样品缓冲液中重悬小球、�/span>

12.将样品煮�?分钟、�/span>

E. Western Blot分析

1.�?5 μL/孔下拉上清液装入聚丙烯酰胺凝�?17%)中、�/span>建议包括预染色MW标准(作为以下步骤3中成功转移的指标)、�/span>

2.按照制造商的说明进行SDS-PAGE、�/span>

3.按照制造商的说明将凝胶蛋白转移到PVDF或硝酸纤维素膜上、�/span>

�?步骤4-11在室温下搅拌

4.电印迹后，将PVDF膜浸�?00%甲醇�?5秒，然后在室温下干燥5分钟、�/span>

�?如果使用硝酸纤维素代替PVDF，应跳过步骤4、�/span>

5.在室温下�?%脱脂干乳�?%牛血清白蛋白在TBST中封闭膜1小时，并持续搅拌、�/span>

6.用TBST清洗3次，每次5分钟、�/span>

7.用抗rab5兔多克隆抗体(Cat、�/span># 21151)，用5%脱脂干牛奶或3% BSA在TBST中以1:50 ~500(取决于样品中Rab5蛋白的量)新鲜稀释，在室温下持续搅拌1-2小时或在4℃过夜、�/span>

8.用TBST清洗3次，每次5分钟、�/span>

9.用二�?Cat、�/span># 29002)，用5%脱脂干乳�?%牛血清白蛋白(BSA)在TBST中以1:1000的比例新鲜稀释，在室温下恒定搅拌1小时、�/span>

10.用TBST清洗3次，每次5分钟、�/span>

11.使用您选择的检测方法，如ECL