大鼠嗅鞘细胞提取物培养步骣�

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养�?MEM:GIBCO,货号11095-080)�?5%；北美胎牛血�?United States，GIBCO，货�?6000-044)�?5%、�/p>

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%� 温度�?7摄氏度，培养箱湿度为70%-80%、�/p>

3）冻存液�?0%*培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存、�/p>

二．细胞处理９�/p>

1）复苏细胞：将含�?mL细胞悬液的冻存管�?7℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离�?分钟，弃去上清液，补�?-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度、�/p>

2）细胞传代：如果细胞密度�?0%-90%，即可进行传代培养、�/p>

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次、�/p>

2.�?ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置�?7℃培养箱中消�?-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化、�/p>

3.�?-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，�?000RPM条件下离�?分钟，弃去上清液，补�?-2mL培养液后吹匀、�/p>

4.将细胞悬液按1�?�?�?的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中、�/p>

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入�?ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存、�/p>