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产品介绍
γ-GT是?谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。?GT催化GSH或者其他?谷氨酰基化合物上的?谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他?谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用、/span> γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中?谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通过测定405nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性、/span> 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测、/span> 产品内容９/span>
溶液的配制： 工作?在试剂一瓶中配制)：临用前配制，把试剂二倒入试剂一瓶中，充分溶?室温过低时可?0℃水浴促进溶?；然后把试剂三倒入试剂一瓶中，混匀后室温保存、/span> 需自备的仪器和用品９/span> 可见分光光度?酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研?匀浆器、冰和蒸馏水、/span> 操作步骤９/span> 一、样本处?可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文? 1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104?：提取液体积(ml)?00?000?的比?建议500万细菌或细胞加入1ml提取?，超声波破碎细菌或细?冰浴，功?0%?00W，超?s，间?0s，重?0??0000rpm 4℃离?0min，取上清，置冰上待测、/span> 2.组织：称取约0.1g样本，加提取?.0ml充分研磨，于4℃，10000rpm离心15min，取上清液待测、/span> 3.血??：直接检测、/span> 二、测定步驞/span> 1.分光光度?酶标仪预?0min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零、/span> 2.试剂二置?5?一般物?或?7?哺乳动物)水浴中预?0min以上(保证无沉淀)、/span> 3.样本测定９/span> 试剂(μL)空白管测定管
混匀后于405nm测定10s时的吸光度，吹打混匀后测?30s时的吸光度，记为A1和A2。计算ΔA测定箠A?-A浊/span>1，ΔA空白箠A?-A?，计算ΔA=ΔA测定?ΔA空白管、/span> 三、?GT活性计箖/span> A、按96孔板计算９/span>1.按样本蛋白浓度计算： 活性单位定义：25℃或?7℃中，每毫克蛋白每分钟催化产?μmol对硝基苯胺为一个活性单位、/span> γ-GT(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总?Cpr×V?÷T=0.845×ΔA÷Cpr 2.按样本质量计算： 活性单位定义：25℃或?7℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位、/span> γ-GT(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总?W÷V提取×V?÷T=0.845×ΔA÷W 3.按血??体积计算９/span> 活性单位定义：25℃或?7℃中，每毫升血清每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位、/span> γ-GT(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷V样÷T=0.845×ΔA 4.按细菌或细胞数量计算９/span> 单位的定义：?万个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位、/span> γ-GT(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总?500×V样÷V提取)÷T=1.69×10-3×ΔA V样：加入样本体积?.02ml；V提取：加入提取液体积?ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度 mg/ml；W：样本质量，g?00：细菌或细胞数量?00万细胞；ε：对硝基苯胺消光系数?870L/mol/cm；d?6孔板光径?.6cm；V反总：反应体系总体积，?×10-4L?06：单位换算系数，1mol=106μmol、/span> B、按微量玻璃比色皿计算： 将上述计算公式中的d=0.6 cm改为d=1cm(比色皿光?、/span> 注意事项９/span> 培养细胞中?GT活性测定时，细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)、/span> |
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