细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关、�/span>

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性、�/span>

产品组成９�/span>

试剂一：粉剂�?瓶，4℃保存。临用前�?00ml蒸馏水充分溶解、�/span>

试剂二：液体×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂三：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加入1ml无水乙醇，充分溶解、�/span>

试剂四：粉�?管，4℃保存。临用前加入0.5ml蒸馏水，充分溶解、�/span>

试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水4ml充分溶解、�/span>

试剂六：液体×1瓶，室温保存、�/span>

试剂七：液�?瓶，4℃保存、�/span>

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前�?.5mlEP管，加入10μl标准液，�?90μl蒸馏水，混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液�?℃保存、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰、�/span>

操作步骤９�/span>

一、粗酶液提取９�/span>

1.除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加�?ml试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离�?0min，取上清液转入超速离心管、�/span>

2.粗制微粒体：4℃，100000g，离�?0min，弃上清液、�/span>

3.除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1ml试剂一，盖紧后充分震荡溶解�?00000g离心30min，弃上清液、�/span>

4.最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂�?.5ml，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用、�/span>

二、AND 活性测定步骤：

1.分光光度�?酶标仪预� 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零、�/span>

2.试剂二置� 37℃水浴中预热 30min、�/span>

3.对照管：� 1� EP管，加入 10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置� 37℃水浴保�?0min；立即加� 35μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL试剂六，混匀后室温静� 5min；室�?000rpm离心 5min；取新的 EP管，加入 100μL上清液，100μL试剂七，混匀� 60℃水�?0min，然后取出，用冷水冷� 5min，于 412nm测定光吸收，记为 A对照管、�/span>

4.测定管：� 1� EP管，加入 10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置� 37℃水浴保�?0min；立即加� 35μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL试剂六，混匀后室温静� 5min；室�?000rpm离心 5min；取 1支新 EP管，加入 100μL上清液，100μL试剂七，混匀� 60℃水� 10min，然后取出，用冷水冷�?min，于 412nm测定光吸收，记为 A测定管、�/span>

5.标准管：� 1� EP管，加入 100μL标准品，100μL试剂七，混匀� 60℃水� 10min，然后取出，用冷水冷� 5min，于 412nm测定光吸收，记为 A标准管。注意：每个样品都需要做对照管、�/span>

三、AND 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计箖�/span>

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛� 1个酶活单位、�/span>

AND活�?nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品�?A测定管－A对照�?÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V�?÷T=45×(A测定管－A对照�?÷A标准管÷Cpr、�/span>

(2)按样本质量计箖�/span>

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产� 1nmol甲醛� 1个酶活单位、�/span>

AND活�?nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品�?A测定管－A对照�?÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管－A对照�?÷A标准管÷W、�/span>

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=0.0001 L；稀释倍数：V反总÷V上清涱�(10+170+10+10+35+35)÷100=2.7� Cpr：粗酶液蛋白质浓�?mg/ml)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒� V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01ml；V样总：提取液体积，0.5ml；W：样本质量，g；T：催化反应时�?min)�?0min、�/span>

b.使用 96孔板测定的计算公式如上�/span>

(1)按蛋白浓度计箖�/span>

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛� 1个酶活单位、�/span>

AND活�?nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品�?A测定管－A对照�?÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V�?÷T=45×(A测定管－A对照�?÷ A标准管� Cpr、�/span>

(2)按样本质量计箖�/span>

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产� 1nmol甲醛� 1个酶活单位、�/span>

AND活�?nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品�?A测定管－A对照�?÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管－A对照�?÷ A标准管÷W、�/span>

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=0.0001 L；稀释倍数：V反总÷V上清涱�(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7� Cpr：粗酶液蛋白质浓�?mg/ml)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒� V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01ml；V样总：提取液体积，0.5ml� W：样本质量，g � T：催化反应时�?min)�?0min、�/span>

注意事项９�/span>

1.粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分装后，-80℃保存；

2.试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用 1周；

3.粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA法测蛋白含量、�/span>