α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化�?酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A、�/span>

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH�?40nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性、�/span>

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测、�/span>

产品内容９�/span>

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	液体110ml×1瓵�/span>	4ℂ�/span>
试剂事�/span>	液体1ml×1瓵�/span>	-20ℂ�/span>
试剂丈�/span>	液体22ml×1瓵�/span>	4ℂ�/span>
试剂囚�/span>	粉剂×1�?/span>	4ℂ�/span>
试剂亓�/span>	粉剂×1�?/span>	4ℂ�/span>
试剂�?/span>	粉剂×1�?/span>	-20ℂ�/span>
试剂丂�/span>	粉剂×1�?/span>	-20ℂ�/span>
试剂�?/span>	粉剂×1瓵�/span>	-20ℂ�/span>

溶液的配制：

1.试剂八：临用前加�?.8 ml双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃避光保存、�/span>

2.工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

紫外分光光度�?酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV�?、研�?匀浆器、冰和蒸馏水、�/span>

操作步骤(仅供参�?９�/span>

一、样本处�?可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文�?

称取�?.1g组织或收集约500万细胞，加入1ml试剂一�?0μL试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4� 11000g离心10min，取上清，置冰上待测、�/span>

二、操作步骣�/span>

1.分光光度计或酶标仪预�?0min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零、�/span>

2.空白管：�?00μL工作液加入微量石英比色皿�?6孔板中，37℃孵�?min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL蒸馏水，混匀并立即测�?40nm�?s的吸光值A1�?7℃准确反�?min，记�?40nm�?min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1、�/span>

3.测定管：�?00μL工作液加入微量石英比色皿�?6孔板中，�?7�?哺乳动物)�?5�?其它物种)孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL样本，混匀并立即测�?40nm�?s的吸光值A3�?7�?哺乳动物)�?5�?其它物种)中准确反�?min，记�?40nm�?min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3、�/span>

三、�?KGDH活性计箖�/span>

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生�?nmol的NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

α-KGDH活�?U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(Cpr×V�?÷T=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生�?nmol的NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

α-KGDH活�?U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算单位的定义：�?万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

α-KGDH活�?U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(V样÷V样总�?00)÷T=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数�?.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径�?cm� V样：加入样本体积�?.012ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积�?.01ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万；109：单位换算系数，1mol=109nmol、�/span>

b.�?6孔板测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生�?nmol的NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

α-KGDH活�?U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(Cpr×V�?÷T=2456.2×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生�?nmol的NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

α-KGDH活�?U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=2480.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算单位的定义：�?万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

α-KGDH活�?U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总�?0⁹]÷(V样÷V样总�?00)÷T=4.962×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数�?.22×10³L/mol/cm；d�?6孔板光径�?.6cm� V样：加入样本体积�?.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积�?.01ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万；109：单位换算系数，1mol=109nmol、�/span>

注意事项９�/span>

1.测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活、�/span>

2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量�?7℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放�?7℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中、�/span>

3.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性、�/span>

4.测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大�?.25，需将样本进行稀释、�/span>

5.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(�?mg/ml)，所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量、�/span>