注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定、�/span>

测定意义

维生� B₆(Vitamin B₆)又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用、�/span>

测定原理

VB₆� 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm有特征吸收峰、�/span>

自备实验用品及仪�?/strong>

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水、�/span>

试剂组成和配刵�/strong>

提取液：液体 70mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂一：液� 1mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂二：液体 5mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂三：液体 8mL×1瓶，4℃避光保存、�/span>

试剂四：液体 8mL×1瓶，4℃避光保存、�/span>

样本处理

1.组织：将样品磨碎，按照质�?g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取�?.1g，加� 0.6mL提取�?加入提取液，60℃浸� 30min，加蒸馏� 0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心 10min，取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟)、�/span>

2.细胞：按照细胞数�?10⁴�?：提取液体积(mL)� 500�?000�?的比�?建议 500万细胞加� 0.6mL提取�?，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超� 3秒，间隔 7秒，总时� 3min)；加蒸馏� 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm离心10min，取上清测定、�/span>

3.血清：直接测定、�/span>

测定操作

	空白箠�/span>	测定箠�/span>
样品(μL)		40
试剂一(μL)	40
试剂�?μL)	40	40
试剂�?μL)	60	60
试剂�?μL)	60	60
充分混匀�?5℃反� 20min，于微量石英比色�?96孔板，测� 390nm处吸光值，记为 A空白管和 A测定管，△A=A测定�?A空白管。空白管只要做一管、�/span>

计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如上�/span>

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R²= 0.9986

1.按照蛋白含量计算

VB₆含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总�?V样×Cpr)= 13.76×(△A - 0.0205)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₆含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总�?V样×W÷V样�?= 13.76×(△A - 0.0205)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₆含量(μg/10⁴cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总�?V样×细胞数量÷V样�?= 13.76×(△A - 0.0205)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₆含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷V栶� 13.76×(△A - 0.0205)

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积�?.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL� Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用 96孔板测定的计算公式如上�/span>

标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R²= 0.9986

1.按照蛋白含量计算

VB₆含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总�?V样×Cpr)= 27.52×(△A - 0.0205)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₆含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818 ×V反总�?V样×W÷V样�?= 27.52×(△A - 0.0205)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₆含量(μg/10⁴cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总�?V样×细胞数量÷V样�?= 27.52×(△A - 0.0205)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₆含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总÷V栶�27.52×(△A - 0.0205)

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积�?.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL� Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1.若测定结果中吸光值超� 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数、�/span>

2.蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数、�/span>

3.显色完成后立即进行测定、�/span>