正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1�?-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子 α-1�?-糖苷键分支点� 4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶 a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺苷�?5�?AMP)存在下可被激活、�/span>

测定原理９�/span>

GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶� 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催� NADP还原生成 NADPH，在 340nm下测� NADPH上升速率，即可反� GP活性。添加一定浓度的腺苷�?5�?AMP)时测� GP(GPa� GPb)活性，未添加腺苷酸(5�?AMP)时测� GPa活性，GP活性－GPa活性得� GPb活性、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

紫外分光光度�?酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制９�/span>

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液� 16 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；

样本的前处理９�/span>

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL提取�?，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

测定步骤９�/span>

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零：�/span>

2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加� 1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

4、试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加� 1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加� 500μL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预� 5分钟：�/span>

7、在微量石英比色皿或 96孔板中加� 10μL样本�?0μL试剂三�?0μL试剂四�?0μL蒸馏水和 160μL工作液，立即混匀，记� 340nm� 5min后的 A1� 10min后的吸光� A2，计� ΔAGPa=A2-A1、�/span>

8、在微量石英比色皿或 96孔板中加� 10μL样本�?0μL试剂三�?0μL试剂四�?0μL试剂五和 160μL工作液，立即混匀，记� 340nm� 5min后的 A3� 10min后的吸光� A4，计� ΔAGP=A4-A3、�/span>

注意：由于每个样本需要同时测一� GP(GPa� GPb)活性和一� GPa活性，因此本试剂盒 100管测 48个样本、�/span>

GPb活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟产� 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

GPb ( nmol/min/mg prot ) � [(ΔAGP � ΔAGPa)×V反总� ( ε×d )×10⁹]÷(V� ×Cpr)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/span>

单位定义：每 g组织每分钟产� 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

GPb ( nmol/min/g鲜重 ) � [(ΔAGP � ΔAGPa)×V反总� ( ε×d )×10⁹]÷(W×V样÷V样�?÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADPH摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径�?cm；V样：加入样本体积�?.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g、�/span>

b.� 96孔板测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟产� 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

GPb ( nmol/min/mg prot ) � [(ΔAGP � ΔAGPa)×V反总� ( ε×d )×10⁹]÷(V� ×Cpr)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/span>

单位定义：每 g组织每分钟产� 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

GPb ( nmol/min/g鲜重 ) � [(ΔAGP � ΔAGPa)×V反总� ( ε×d ) ×10⁹]÷(W ×V样÷V样�?÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADPH摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d�?6孔板光径�?.5cm；V样：加入样本体积�?.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g、�/span>