正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/strong>

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶，催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种解毒反应、�/p>

测定原理９�/strong>

AS催化 L-天冬酰胺水解� L-天冬氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性、�/p>

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水、�/p>

试剂组成和配制：

试剂一：液� 60mL×2瓶，4 ℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，4 ℃避光保存；临用前每瓶加�25mL蒸馏水充分溶解待用，现配现用：�/p>

试剂三：液体 60 mL×1瓶，常温保存：�/p>

试剂四：液体 5 mL×1瓶，常温保存：�/p>

试剂五：液体 3 mL×1瓶，常温保存：�/p>

试剂六：液体3 mL×1瓶，常温避光保存、�/p>

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴�?：试剂一体积(mL)� 500�?000�?的比�?建议 500万细菌或细胞加入 1mL试剂一)，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3s，间� 10s，重� 30�?�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

组织：按照组织质�?g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL试剂一)，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

2、血�?�?样品：直接检测、�/p>

测定步骤９�/strong>

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零、�/p>

2、样品测�?� EP管中加入下列试剂)９�/p>

试剂名称(uL)	测定箠�/td>	对照箠�/td>
样本	25
蒸馏氳�/td>		25
试剂一	100	100
试剂事�/td>	400	400

混匀�?7℃水� 1小时

试剂丈�br/>

525

525

混匀�?000 g�?5℃离� 10 min；取上清液，� EP管或 96孔板中加入下列试剁�/p>

上清涱�br/>	130	130
试剂囚�/td>	30	30
试剂亓�/td>	20	20
试剂�?/td>	20	20

混匀，室温静� 15min�?20nm处读取测定管和对照管吸光值，计算 ΔA=A测定�?A对照管。对照管只要做一管、�/p>

注意９�/strong>

1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用�?、ΔA(A测定�?A对照�?若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间 1h延长�?h，相应的在计算公式中除以 2、�p>酶活性计算：

标准条件下测定的回归方程� y = 1.9244x + 0.0057，R²= 0.9983；x为标准品浓度(μmol/mL)，y为吸光� A、�/p>

1、血�?�?AS活�?/p>

单位定义：每 mL血�?�?� min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位、�/p>

AS (nmol/min/mL)� (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷V样÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA -0.0057)

2、组织、细菌或细胞 AS活�?/p>

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每 mg蛋白质每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位、�/p>

AS (nmol/min/mg prot)� (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总�?V样×Cpr)÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA

-0.0057)÷Cpr、�/p>

(2)按样本鲜重计算：

单位定义：每 g组织� min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位、�/p>

AS (nmol/min/g鲜重)�?ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总�?W×V样÷V样�?÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA-0.0057)÷W、�/p>

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1万个细菌或细胞每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位、�/p>

AS (nmol/min/104 cell) � (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总�?500×V样÷V样� )÷T×10⁰⁰=0.7274×(ΔA -0.0057)

V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V反总：反应体系总体积，1.05mL� V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量， g�?00：细菌或细胞总数�?00万； 1000，μmol� nmol换算系数、�/p>