正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

顺乌头酸�?aconitase)，三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备、�/span>

测定原理

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+还原生成 NADH，导� 340nm处光吸收上升、�/span>

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器�?mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制

试剂一�?0mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体 60mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：液体 5mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加3mL蒸馏水充分溶解；现配现用

试剂七：粉剂×1支，4°保存；临用前�36mL试剂四充分溶解；

工作液：临用前在36mL试剂七中加入3mL蒸馏水�?strong>3mL试剂四�?strong>3mL试剂五�?strong>3mL试剂六充分混匀

样本的前处理９�/span>

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离９�/span>

1、称取约 0.1g组织或收� 500万细胞，加入 1mL试剂一� 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆、�/span>

2、将匀浆转入离心管� 600g�?℃离� 5min、�/span>

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中�?1000g�?℃离� 10min、�/span>

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性、�/span>

5、在步骤④的沉淀中加� 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破�?冰浴，功� 20%�?00W，超� 3秒，间隔 10秒，重复 30�?，用于线粒体顺乌头酸酶活性测定、�/span>

测定步骤

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/span>

2、样本测宙�/span>

(1)将工作液，置� 37�?哺乳动物)� 25�?其它物种)水浴 10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用、�/span>

(3)� 1mL石英比色皿中加入 100μL样本 900μL工作液，混匀，立即记� 340nm� 20s时的吸光� A1� 3min20s后的吸光� A2，计算ΔA=A2-A1、�/span>

ACO活性计箖�/span>

用石英比色皿测定的计算公式如上�/span>

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

单位的定义：� mg组织蛋白每分钟生� 1 nmol� NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

ACO活�?nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V�?÷T=536×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/span>

单位的定义：� g组织每分钟生� 1 nmol� NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

ACO(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样�?÷T=108×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：� 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol� NADH定义为一个酶活性单位、�/span>

ACO活�?nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样�?÷T=0.722×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径�?cm；V样：加入样本体积�?.1 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万、�/span>