注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定、�/span>

测定意义９�/span>

ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等、�/span>

测定原理９�/span>

酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在 680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算 ACP活性、�/span>

自备仪器和样品：

水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板�?.5 mL EP管和蒸馏水、�/span>

试剂组成和配置：

液体一�?mL×1支，4℃保存、�/span>

液体二：1mL×1支，4℃保存、�/span>

试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水=90(μL)９�strong>20(μL)９�strong>21(mL)的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用、�/span>

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前� 4mL蒸馏水溶解、�/span>

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入 10mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解�?可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加� 15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使�?、�/span>

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 20mL蒸馏水溶解。试剂五：液� 4mL×1瓶，4℃保存、�/span>

标准品：液体 1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存、�/span>

粗酶液提取：

1、试剂一的配制：见试剂的组成和配制、�/span>

2、组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL试剂一)冰浴匀浆，8000g�?℃离� 10min，取上清，即粗酶液、�/span>

3、血清或培养液：直接测定、�/span>

4、细菌、真菌：按照细胞数量(10⁴�?：试剂一体积(mL)� 500�?000�?的比�?建议 500万细胞加� 1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超� 3秒，间隔 7秒，总时� 3min)；然� 8000g�?℃，离心 10min，取上清置于冰上待测、�/span>

测定操作９�/span>

1.分光光度�?酶标仪预� 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零、�/span>

2.试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保� 30min、�/span>

3.对照管：� 0.5 mL EP管，加入 20μL粗酶液，40μL试剂二，混匀后置� 30℃水浴保�?0min；加� 40μL试剂三，混匀� 8000g�?℃离� 10min；取 40μL上清液，加入新的 EP管，再加� 200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置� 30℃水浴保� 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板�?80nm测定光吸收，记为 A对照管、�/span>

4.测定管：� 0.5 mL EP管，加入 20μL粗酶液，40μL试剂三，混匀后置� 30℃水浴保�?0min；加� 40μL试剂二，混匀� 8000g�?℃离� 10min；取 40μL上清液，加入新的 EP管，再加� 200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置� 30℃水浴保� 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A测定管�?注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二)

5.空白管：� 0.5 mL EP管，加入 40μL蒸馏水，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置�?0℃水浴保� 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A空白管、�/span>

6.标准管：� 0.5 mL EP管，加入 40μL标准品，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置�?0℃水浴保� 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A标准管、�/span>

ACP活性计算公式：

1.按照样本蛋白浓度计算

ACP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产� 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位、�/span>

ACP活�?nmol/min/mg prot)= C标准品�?A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?×V反总�?Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?÷Cpr

2．按照样本质量计箖�/span>

ACP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位、�/span>

ACP活�?nmol/min/g鲜重)=C标准品�?A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?×V反总�?W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?÷W

3.按照液体体积计算

ACP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产� 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位、�/span>

ACP活�?nmol/min/mL)=C标准品�?A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?

1.按照细胞数量计算

ACP活性单位定义：30℃每 10⁴个细胞每分钟催化水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位、�/span>

ACP活�?nmol/min/104 cell)=C标准品�?A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?×V反总�?细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管－A对照�?÷(A标准管－A空白�?÷细胞数量

C标准品：0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓�?mg/mL)；V1：加入反应体系中粗酶液体�?mL)�?.02 mL；V2：提取液总体�?mL)�?mL；T：催化反应时�?min)�?0min；W：样品质�?g)、�/span>

注意事项９�/span>

1.试剂一按操作指示配制，用多少配多少，出现白色絮状沉淀则不能用、�/span>

2.临用前配制的试剂配置好后 3天内使用完毕、�/span>