正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

C4H又称反式肉桂�?4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟化作用产生 4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的**个关键酶、�/span>

测定原理９�/span>

C4H催化肉桂酸和 NADP生成 4-香豆酸盐� NADPH，在 340nm下测� NADPH生成速率，即可反� C4H活性、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器�?mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制９�/span>

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液� 60 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴�?：提取液体积(mL)� 500�?000�?的比�?建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取�?，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3s，间� 10s，重� 30�?�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

组织：按照组织质�?g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL提取�?，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

测定步骤９�/strong>

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/span>

2、样本测宙�/span>

(1)取试剂二一瓶，加入 25mL试剂一充分溶解混匀，置� 37�?哺乳动物)� 25�?其它物种)水浴 5min；现配现�?配好� 24h内用�?：�/span>

(2)� 1mL石英比色皿中加入 50μL样本� 950μL试剂二，混匀，立即记� 340nm处初始吸光� A1� 5min后的吸光� A2，计� ΔA=A2-A1、�/span>

C4H活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：� mg组织蛋白每分钟产� 1 nmol� NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

C4H(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：� g组织每分钟产� 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

C4H(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样�?÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/span>

单位的定义：� 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位、�/span>

C4H(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样�?÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：NADPH摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径�?cm；V样：加入样本体积�?.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万、�/span>