注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定、�/span>

测定意义９�/span>

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2氧化 AsA，是� AsA的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量，APX� AsA具有一定的负相关性、�/span>

测定原理９�/span>

APX催化 H2O2氧化 AsA，通过测定 AsA氧化速率，来计算� APX活性、�/span>

自备仪器用品９�/span>

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV�?、移液枪、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂组成和配制：

试剂一：液� 120mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前� 3 mL蒸馏水充分溶解、�/span>

试剂三：液体 3mL×1支，4℃保存、�/span>

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL试剂一)进行冰浴匀浆�?3000g�?℃离� 20min，取上清置冰上待测、�/span>

测定９�/span>

1.分光光度�?酶标仪预� 30 min以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零、�/span>

2.试剂一� 25℃中预热 30min、�/span>

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加� 20μL上清液�?40μL预热的试剂一 20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在 290nm测定 10s� 130s光吸� A1� A2，△A=A1-A2、�/span>

APX活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(Cpr×V�?÷T=1786×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计箖�/span>

活性单位定义：� g组织每分钟氧� 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

APX(nmol/min/g鲜重 ) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(W×V样÷V样�?÷T=1786×△A÷W

ε：AsA� 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×10³L/mol/cm；d：比色皿光径(cm)�? cm；V反总：反应体系总体�?L)�?00μL=2×10^-4L�?0⁹�?mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓�?mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)�?0μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL� T：催化反应时�?min)�?min、�/span>

b.使用 96孔板测定的计算公式如上�/span>

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(Cpr×V�?÷T=3571×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计箖�/span>

活性单位定义：� g组织每分钟氧� 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

APX(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(W×V样÷V样�?÷T=3571×△A÷W

ε：AsA� 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×10³L/mol/cm；d�?6孔板光径(cm)�?.5 cm；V反总：反应体系总体�?L)�?00μL=2×10^-4L�?0⁹�?mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓�?mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)�?0μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL� T：催化反应时�?min)�?min、�/span>

注意事项９�/span>

配制好的试剂� 4℃保存，并且 3天内使用完、�/span>