注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定、�/span>

测定意义９�/span>

AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和 AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化 AsA所形成� MDHA可通过质膜上的细胞色素 b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长、�/span>

测定原理９�/span>

AAO可直接氧� AsA，通过测定 AsA的氧化量，可计算� AAO活力、�/span>

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV�?、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水、�/span>

试剂组成和配制：

试剂一：液� 100mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂二：液体 20mL×1瓶，4℃保存、�/span>

试剂三：粉剂×2瓶，4℃避光保存、�/span>

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL试剂一)进行冰浴匀浆�?6000g�?℃离� 10min，取上清置冰上待测、�/span>

AAO测定操作９�/strong>

1.分光光度�?酶标仪预� 30 min，调节波长到 265 nm、�/span>

2.试剂二在 25℃水浴锅中预� 30 min、�/span>

3.� 1瓶试剂三，加� 1mL蒸馏水充分溶解；配好的试剂三 3天内用完、�/span>

4.工作液的配制：将试剂二与试剂三按 170(μL)�?0(μL)的比例混合，用多少配多少、�/span>

5.依次在微量石英比色皿/96孔板中加� 20μL上清液�?80μL工作液，迅速混匀后在 265nm测定 10s� 130s光吸� A1� A2，△A =A1-A2、�/span>

AAO活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1).按蛋白浓度计箖�/span>

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

AAO(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(Cpr×V�?÷T= 92.4×△A÷Cpr

(2).按样本质量计箖�/span>

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧� 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

AAO(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(W×V样÷V样�?÷T= 92.4×△A÷W

ε：AsA� 265nm处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径(cm)�? cm� V反总：反应体系总体�?L)�?00μL=2×10^-4L�?0⁹�?mol=1×10⁹μmol；Cpr：上清液蛋白质浓�?mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)�?0μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL� T：催化反应时�?min)�?min、�/span>

b.使用 96孔板测定的计算公式如上�/strong>

(1).按蛋白浓度计箖�/span>

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

AAO(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(Cpr×V�?÷T=184.8×△A÷Cpr

(2).按样本质量计箖�/span>

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧� 1nmol AsA� 1个酶活单位、�/span>

AAO(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总�?0⁹÷(W×V样÷V样�?÷T= 184.8×△A÷W

ε：AsA� 265nm处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴L/mol/cm；d�?6孔板光径(cm)�?.5 cm� V反总：反应体系总体�?L)�?00μL=2×10^-4L�?0⁹�?mol=1×10⁹μmol；Cpr：上清液蛋白质浓�?mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公� BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)�?0μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL� T：催化反应时�?min)�?min、�/span>