体外均相时间分辨荧光技术（HTRF）测� PI3K 抑制:

�?84孔聚丙烯母板上，化合� (3倍溶�?00% DMSO) �?列到12列，�?3列到24列连续稀释，获得11种浓� GSK2126458�?列和18列只含DMSO。滴定后�?.05��L 立即转移�?84孔低容量实验板上� 实验板中�?种药物对�?PI3K 抑制�?�?组实验对�? (1) 不含抑制剂的酶实骋�(2) 去酶buffer, � (3)去酶� PIP3的buffer。DMSO加到6列和18列的所有孔中�?0 ��M PIP3加到 1X 反应 buffer (1��L 200 ��M PIP3)中， 交替 18列的行数 ( B, D, F, H, J, L, N, P)。不含酶的对照实验在 A, C, E, G, I, K, M, O孔中 (0.1��L 100% DMSO)中进行。使� HTRF试剂盒优化PI3K 实验 。实验试剂盒中含7种试剁� 1) 4X 反应Buffer; 2) PIP2 (底物); 3) Stop A (EDTA); 4) Stop B (生物�?PIP3); 5) 检测混合物A (链霉亲和�?APC); 6)检测混合物 B (Eu-标记的抗-GST抗体� GST标记� PH�?; 7) 检测混合物 C (KF)。通过使用去离子水�?:4稀释而制备PI3K反应 Buffer。加入新鲜制备的 DTT，终浓度�? mM。加入酶，使用Multidrop Combi �?X反应 buffer中加�?.5��L PI3K，加到每孔中 ，开始预温育化合物。实验板在室温下温育15分钟� 使用Multidrop Combi，加� 2.5��L 2X底物溶液(PIP2� ATP，溶� 1X 反应buffer)开始反应。实验板在室温下温育1小时� 使用Multidrop Combi在所有孔中加�?.5��L 终止� (Stop A� Stop B�?:1比例预混�?，反应淬灭。使用Mulitdrop Combi(检测混合物 C, 检测混合物 A,和检测混合物 B �?8:1:1比率混合，即: 6000 ��L 总体�? 混合 5400 ��L 检测混合物 C, 300��L 检测混合物 A, � 300 ��L 检测混合物 B)在所有孔中加�?.5��L 检测液，进行淬火反应，检测形成的产品。备�?这种溶液在使用前2小时制备。在暗中温育1小时后，在Envision 酶标仪上测量HTRF信号，在330nm 处测定激发光，在620nm (Eu) �?65nm (APC)处双重发射光、�/p>

细胞实验

Cell lines: BT474, HCC1954 � T-47D

Concentrations: 0 � 1 ��M

Incubation Time: 72 小时

Method: BT474, HCC1954 � T-47D(人类乳腺)培养在含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中，培养在37oC下含 5% CO2� 孵育器中。在实验�?�?天，细胞按密度分到T75 烧瓶中，这样在实验收集时获得�?0-80% 细胞汇合。使�?.25% 胰蛋白酶-EDTA收集细胞。在细胞悬液中使用台酚蓝染色排除染色，进行细胞计数。细胞按每孔1000个细胞接种在384孔黑色平底聚苯乙烯板中， 每孔�?8 ��L 培养基。所有实验板置于5% CO2, 37oC 下过夜，第二天加� GSK2126458。使用CellTiter-Glo处理一个实验板，用于第一天测量。GSK2126458 在清澈见底的聚丙�?84孔板中制备，连续稀释两倍�? ��L 这些稀释液加到105 ��L 培养基中混合溶液�? 细胞板的每孔中加�? ��L这些稀释液。所有孔中的 DMSO 终浓度为0.15%。细胞在37oC, 5% CO2 环境中温� 72小时。随后与 GSK2126458温育72小时。CellTiter-Glo试剂加到实验板中，使用与孔中细胞培养体积相当量的体积。震荡实验板�?分钟，在室温下温育约30分钟，然后在Analyst GT 读数器上读取化学分光信号、�/p>

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动物实验

Animal Models: 在小鼠体内移植BT474肿瘤

Formulation: GSK2126458 溶于DMSO，然后在水中稀釉�/p>

Dosages: �?00 ��g /kg

Administration: 口服处理

(Only for Reference)

参考文�?/b>