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腺伴随病毒染料法荧光定量PCR试剂盒
腺伴随病毒染料法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Adeno-associated Virus(AAV) SYBR qPCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

腺伴随病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属细小病毒科,病毒颗粒直径为20nm,无包膜,20面体,为目前动物病毒中最简单的一类单链线状 DNA病毒。在普通人群中,AAV感染率很高,85%的人呈血清抗体阳性,但是未发现 AAV引起人体疾病,甚至早年的流行病学研究报告认为,AAV感染者减少了患癌的危险性,对人体医学研究具有重要意义,因此腺伴随病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用,为此本公司开发了简单快捷的腺伴随病毒染料法荧光定量 PCR检测试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供病毒样品。

2、根据腺伴随病毒保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。

3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4、一管式荧光定量 PCR检测,避免后续污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研,不能用于临床诊断。

规格及成分

成分 编号 十孔盒包装
2×qPCR MagicMix 90408 500μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液 180701 1 mL(黄盖)
腺伴随病毒 PCR引物混合物 14-62400yw 100μL(白盖)
腺伴随病毒 PCR阳性对照(1×108拷贝/μL) 14-62400pc 50μL(红盖)
DNA病毒裂解液(试用装) 3674a 15次(9 mL)
使用手册 14-62400sc 1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头,下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照,充分震荡 1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头,在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照到 5号管中,充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品,必须设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的 PCR阳性对照的第 4号(浓度为 1×104拷贝/μL,10μL相当于 1万拷贝)或第 5号(浓度为 1×105拷贝/μL,10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL样品,则 PC和 NC的体积也必须是 200μL。

9、用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15次一管式病毒 DNAout。

三、设置 qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)

10、如果只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照,6个用于 PCR阳性对照。如果做 2-3次重复,则反应设置数量相应增加 2或 3倍。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分 样品管N+2个 PCR阴性对照管 PCR阳性对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管) 10 μL 10 μL 各 10 μL
腺伴随病毒 PCR引物混合液(白盖) 2 μL 2 μL 各 2 μL
自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2待测样品 DNA模板 6 μL 不加 不加
第 7步所得 PCR阳性对照稀释液(2-7号) 不加 不加 各 6μL(2号样到2号管,3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照,其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。

12、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

过程
温度
时间
预变性 90℃ 5分钟
PCR反应(30个循环) 92℃ 60秒
PCR反应(30个循环) 56℃ 60秒
PCR反应(30个循环) 74℃ 60秒

13、数据采集

具体操作按所用半岛游戏平台官网入口网址 推荐的流程进行。本半岛bd体育手机客户端 中所含的荧光染料在不结合 DNA时,最大吸收光谱在 471 nm,结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm,最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 40则为阴性,如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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