产品及特炸�/strong>

登革病毒(Dengue Virus，DENV)是一� RNA病毒，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，可以引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征，登革热病毒分化成四大家族，被病毒学家称为 DF-1、DF-2� DF-3、DF-4病毒型。本产品是基于染料法荧光定量 PCR原理开发，专门检测登革病� 2型的试剂盒。它具有下列特点９�/span>

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照、�/span>

2、根据登革病� 2型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性、�/span>

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR� 10-100倍，可以达到至少 1000拷贝/反应、�/span>

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT� PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染、�/span>

5、本产品足够 50� 20μL体系� RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床、�/span>

规格及成刅�/strong>

成份	编号	十孔盒包裄�/span>
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	190101a	500 μL(棕色�?
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料 I�?0×	190101c	20 μL(棕色�?
ROX染料 II�?0×	190101d	20 μL(棕色�?
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1mL(黄盖)
登革病毒 2型染料法 qRT-PCR引物混合涱�/span>	14-64820yw	100 μL(白盖)
登革病毒 2型染料法 qRT-PCR阳性对�?1×108拷贝/μL)	60908-64820pc	50 μL(黄盖)
使用手册	14-64820sc	1仼�/span>

运输及保字�/strong>

低温运输�?20℃保存，保存期限� 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提� RNA片段作为阳性对照、�/span>

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对�?� 10²-10⁷� 6� 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原、�/span>

1、标� 6个离心管，分别为 7�?�?�?�?�?。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液�?*用带芯枪头，下同)、�/span>

2、在 7号管中加� 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对�?本试剂盒提供)，充分震� 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

3、换枪头，在 6号管中加� 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

4、换枪头，在 5号管中加� 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用、�/span>

二、样� RNA的制夆�/span>

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对�?，一个是 NC(样品制备阴性对�?。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的� 4�?浓度� 1×10⁴拷贝/μL�?0μL相当� 1万拷�?再加上一定量的水作为制备的阳性对�?加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要�?。可以用水作为制备的阴性对照、�/span>

6、用自选方法纯� N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout、�/span>

三、设� RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进�?

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标� N+9� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标� N+4� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对�?用水做模�?�?个用� PCR阳性对�?用第 4号阳性对照稀释液做模�?。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变、�/span>

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)９�/span>

成分	N+2个制备所得样�?/span>	RT-PCR阴性对�?/span>	RT-PCR阳性对�?2-7�?
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	10μL	10μL	� 10μL
登革病毒2型染料法qRT-PCR引物混合涱�/span>	2μL	2μL	� 2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	� 0.4μL
样品制备所� RNA模板(来于� 8�?	5.6μL	-	-
稀释所� 6个阳性对�?来于� 6�?	-	-	� 5.6μL(2号样� 2号管�?号样� 3号管�?
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

�?需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000�?300�?700�?900HT、Step-One、Step-One Plus、�/span>

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500�?500Fast、MJ Research� Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000、�/span>

不需要使� ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System� LightCycler � Smart Cycler System � Agilent Mx3000P � RotorGene3000、RotorGene 6000、�/span>

9、上机后按下面参数进� RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)、�/span>

过程	温度	时间
RT(逆转�?	50ℂ�/span>	30 min
预变�?/span>	95ℂ�/span>	10 min
qPCR反应(40个循�?	95ℂ�/span>	15 sec
qPCR反应(40个循�?	60ℂ�/span>	1 min(采集 SYBR通道的荧光信�?
按仪器预设程序进行熔解曲线分枏�/span>

四、数据处琅�/span>

10、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对� Ct必须大于或等� 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等� 40则为阴性，如果小于或等� 35则为阳性、�/span>