产品及特炸�/strong>

本产品是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测河流弧菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样� DNA模板、�/span>

2、引物和探针经过优化，灵敏性高、�/span>

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品、�/span>

4、特异性高，引物是根据河流弧菌高度保守区设计、�/span>

5、本产品足够 50� 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应、�/span>

6、本产品只能用于科研、�/span>

规格及成刅�/strong>

成分	编号	十孔盒包裄�/span>
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL(本色�?
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
河流弧菌探针� qPCR引物混合涱�/span>	15-14840yw	100 μL(白盖)
河流弧菌 qPCR探针	15-14840pb	50 μL(棕色�?
河流弧菌探针� qPCR阳性对�?1×108拷贝/μL)	60908-14840pc	50 μL(黄盖)
使用手册	15-14840sc	1仼�/span>

运输及保字�/strong>

低温运输�?20℃保存，保存期限� 12个月、�/span>

自备试剂

样品 DNA、�/span>

使用方法

一、稀释标准曲线样�?� 10²-10⁷拷贝/μL� 6� 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成�?。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照、�/span>

1、标� 6个离心管，分别为 7�?�?�?�?�?、�/span>

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液�?*用带芯枪头，下同)、�/span>

3、在 7号管中加� 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对�?试剂盒提�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

4、换枪头，在 6号管中加� 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

5、换枪头，在 5号管中加� 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

二、样� DNA的制夆�/span>

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对�?，一个是 NC(样品制备阴性对�?。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作� NC、�/span>

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容、�/span>

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进�?

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标� N+9� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对�?用水做模�?�?个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标� N+4� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对�?用水做模�?�?个用� PCR阳性对�?用第 4号管的阳性对照稀释液做模�?。下面只以定量分析为例描述操作步骤、�/span>

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)９�/span>

成分	样品管N+2�?/span>	PCR阴性对照管	标准曲线样品�?2-7�?
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	� 10 μL
河流弧菌 qPCR探针	1 μL	1 μL	� 1 μL
河流弧菌探针� qPCR引物混合涱�/span>	2 μL	2 μL	� 2 μL
N+2个待� DNA模板	7 μL	-	-
超纯氳�/span>	-	7 μL	-
� 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7�?	-	-	� 7 μL(2号样�?号管�?号样� 3号管�?

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR９�/span>

过程	温度	时间
预变�?/span>	95ℂ�/span>	5 min
PCR反应(40个循�?	95ℂ�/span>	15sec
PCR反应(40个循�?	60ℂ�/span>	1 min(采集 FAM通道的荧光信�?

四、数据处琅�/span>

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度� log值，再推算出其浓度、�/span>

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对� Ct必须大于或等� 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等� 35则为阴性，如果小于或等� 30则为阳性。如果在 30-35之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小� 35，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性、�/span>