产品及特炸�/strong>

布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，其病原布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌，感染后，主要引起动物流产和人的波状热。布鲁氏菌无经典的毒力因子，如质粒，外毒素，溶细胞素，荚膜或内毒素特性的脂多糖分子，其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在胞内存活的能力，基于此，布鲁氏菌能感染宿主建立慢性感染，较难被清除。本公司开发了流产布鲁氏菌染料法荧光定� PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提� DNA模板、�/span>

2、引物根据流产布鲁氏菌专一区设计，特异性高、�/span>

3、荧光定� PCR检测，比常� PCR更加灵敏、�/span>

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染、�/span>

5、本试剂盒足� 50� 20μL反应体系的荧光定� PCR、�/span>

6、本产品只适用于科研，不能用于临床诊断、�/span>

规格及成刅�/strong>

成分	编号	塑料盒包裄�/span>
2×qPCR MagicMix	90408	500 μL(棕色�?
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
流产布鲁氏菌染料� qPCR引物混合涱�/span>	14-61210yw	100 μL(白盖)
流产布鲁氏菌染料� qPCR阳性对�?1×108拷贝/μL)	60908-61210pc	50 μL(黄盖)
使用手册	14-61210sc	1仼�/span>

运输及保字�/strong>

低温运输�?20℃保存，有效期一年、�/span>

自备试剂

DNA模板、超纯水�?0×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)、�/span>

使用方法

一、稀� PCR阳性对�?� 10²-10⁷拷贝/μL� 6� 10倍稀释度为例)

1、注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成�?、�/span>

2、标� 6个离心管，分别为 7�?�?�?�?�?、�/span>

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)、�/span>

4、在 7号管中加� 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

5、换枪头，在 6号管中加� 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

6、换枪头，在 5号管中加� 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用、�/span>

二、样� DNA的制夆�/span>

8、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对�?，一个是 NC(样品制备阴性对�?。可以用 10μL PCR阳性对照的 10000倍稀释的(稀释后浓度� 1×10⁴拷贝/μL�?0μL相当� 10万拷贝，可以� 10μL原液加入� 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此� 100倍稀释液。再� 10μL此稀释液加入� 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此� 10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对�?加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要�?。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样� DNA、�/span>

9、用自选方法纯� N+2个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容、�/span>

三、设� qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进�?

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标� N+9� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标� N+4� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对�?用水做模�?�?个用� PCR阳性对�?用第 4号阳性对照稀释液，浓度为 10⁴拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变、�/span>

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)９�/span>

成分	样品管N+2�?/span>	PCR阴性对照管	PCR阳性对照管(2-7�?
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	� 10 μL
流产布鲁氏菌染料� qPCR引物混合涱�/span>	2 μL	2 μL	� 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	� 2 μL
N+2待测样品 cDNA模板	6 μL	-	-
自备超纯氳�/span>	-	6	-
� 7步所� PCR阳性对照稀释液(2-7�?	-	-	� 6μL(2号样�?号管�?号样� 3号管�?

�?� ABI7500�?700� 7900仪器需要使� ROX作为对照，其他荧� PCR仪器(� iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000� LightCycler480)不需要使� ROX，则用水替代、�/span>

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优�?、�/span>

过程	温度	时间
预变�?/span>	95ℂ�/span>	5 min
PCR反应(40个循�?	95ℂ�/span>	15 sec
PCR反应(40个循�?	60ℂ�/span>	1 min�?采集 SYBR通道的荧光信�?
按仪器预设程序进行熔解曲线分枏�/span>

四、数据处琅�/span>

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度� log值，再推算出其浓度、�/span>

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对� Ct必须大于或等� 34。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct大于或等� 34则为阴性，如果小于或等� 30则为阳性。如果在 30-34之间，可结合熔解曲线判断，若样品的熔解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性、�/span>