产品及特炸�/strong>

牛病毒性腹泻病�?Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)是一� RNA病毒，会引起牛病毒性腹泻，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。传染来源主要是病畜，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或，间接接触方式传播。该病主要在消化道和淋巴组织，口腔、咽部、鼻镜出现不规则烂斑、溃疡，以食道黏膜呈虫蚀样烂�?*特征。流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内有出血斑及溃疡。运动失调的犊牛，严重的可见到小脑发育不全及两侧脑室积水，给养殖业带来严重的经济损失。本产品是基于染料法荧光定量 PCR原理开发，专门检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。它具有下列特点９�/span>

1、一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照、�/span>

2、根据牛病毒性腹泻病毒基因组的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性、�/span>

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR� 10-100倍、�/span>

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT� PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染、�/span>

5、本产品足够 50� 20μL体系� RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床、�/span>

规格及成刅�/strong>

成份	编号	五孔盒包裄�/span>
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	190101a	500 μL(棕色�?
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(绿盖)
牛病毒性腹泻病毒染料法qRT-PCR引物混合涱�/span>	14-59800yw	100 μL(白盖)
牛病毒性腹泻病毒染料法qRT-PCR阳性对�?1×107拷贝/μL)	59800pc	50 μL(黄盖)
使用手册	14-59800sc	1仼�/span>

运输及保字�/strong>

低温运输�?20℃保存，保存期限� 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供核酸片段作为阳性对照、�/span>

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对�?� 10E1-10⁶� 6� 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原、�/span>

1� 标记 6个离心管，分别为 6�?�?�?�?�?。用带芯枪头分别加入 45μL荧光PCR专用模板稀释液�?*用带芯枪头，下同)、�/span>

2、在 6号管中加� 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?本试剂盒提供)，充�?、换枪头，在 4号管中加� 5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用、�/span>

二、样� RNA的制夆�/span>

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对�?，一个是 NC(样品制备阴性对�?。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的� 4�?浓度� 1×10⁴拷贝/μL�?0μL相当� 10万拷�?再加上一定量的水作为制备的阳性对�?加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要�?。可以用水作为制备的阴性对照、�/span>

6、用自选方法纯� N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout、�/span>

三、设� RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进�?

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标� N+9� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只� 1次重复，则标� N+4� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对照，1个用� PCR阳性对�?用第4号阳性对照稀释液做模�?。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变、�/span>

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子关闭盖子后最后添�?９�/span>

成分/每管	N+2个制备所得样�?/span>	RT-PCR阴性对�?/span>	RT-PCR阳性对�?1-6�?
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	10 μL	10 μL	10 μL
牛病毒性腹泻病毒染料法qRT-PCR引物混合涱�/span>	2 μL	2 μL	2 μL
样品制备所得RNA模板(来于� 6�?	6 μL	-	-
稀释所� 6个阳性对�?来于� 4�?	-	-	6 μL(1号样�?号管�?号样�?号管�?
10×qRT-PCR酶混合液	2 μL	2 μL	2 μL

�?个别qPCR仪器型号需要添加ROX染料校正，以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据、�/span>

需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000�?300�?700�?900HT、Step-One、Step-One Plus，建议终浓度500nM、�/span>

需使用 ROX染料 II的机型：� ABI Prism 7500 �?500Fast 、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000，建议终浓度50nM、�/span>

9、上机后按下面参数进� RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)、�/span>

过程	温度	时间
RT(逆转�?	50ℂ�/span>	20 min
预变�?/span>	95ℂ�/span>	10 min
qPCR反应(40个循�?	95ℂ�/span>	15 sec
qPCR反应(40个循�?	56ℂ�/span>	30 sec
qPCR反应(40个循�?	72ℂ�/span>	45 sec(采集 SYBR通道的荧光信�?
按仪器预设程序进行熔解曲线分枏�/span>

四、数据处琅�/span>

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度� log值，再推算出其浓度、�/span>

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于34。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小�?2。对待测样品，如果其Ct�?4则为阴性，如果�?2则为阳性。如果在32-34之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果≥34则为阴性，如果小于34，则为阳� 。熔解曲线也须一并考虑，如果熔� Tm值与目的扩增片段 Tm值相差≥2℃，则为非特异性扩增，不是真正的阳性扩增、�/span>