产品及特炸�/span>

非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)会引起非洲马瘟，是一种马属动物的急性或亚急性传染病，该病以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高� 95%。本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本公司产品开发非洲马瘟病毒染料法荧光定量 RT-PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照、�/span>

2、根据非洲马瘟病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性、�/span>

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR� 10-100倍，可以达到至少 1000拷贝/反应、�/span>

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT� PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染、�/span>

5、本产品足够 50� 30μL体系� RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床、�/span>

规格及成刅�/span>

成份	编号	十孔盒包裄�/span>
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	190101a	500 μL(棕色�?
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料 I�?0×	190101c	20 μL(棕色�?
ROX染料 II�?0×	190101d	20 μL(棕色�?
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1mL(黄盖)
非洲马瘟病毒染料� qRT-PCR引物混合涱�/td>	14-10900yw	100 μL(白盖)
非洲马瘟病毒染料� qRT-PCR阳性对�?p>(1×108拷贝/μL)	60908-10900pc	50 μL(黄盖)
核酸释放�?试用�?	61202	20�?1mL，绿�?
使用手册	14-10900sc	1仼�/span>

运输及保字�/span>

低温运输�?20℃保存，保存期限� 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提� DNA片段作为阳性对照、�/span>

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对�?� 10²-10⁷� 6� 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原、�/span>

1、标� 6个离心管，分别为 7�?�?�?�?�?。用带芯枪头分别加入 45 μL�?/span>

� PCR专用模板稀释液�?*用带芯枪头，下同)、�/span>

2、在 7号管中加� 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对�?本试剂盒提供)，充分震� 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

3、换枪头，在 6号管中加� 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用、�/span>

4、换枪头，在 5号管中加� 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震� 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用、�/span>

二、样� RNA的制夆�/span>

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对�?，一个是 NC(样品制备阴性对�?。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的� 4�?浓度� 1×10⁴拷贝/μL�?0μL相当� 1万拷�?再加上一定量的水作为制备的阳性对�?加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要�?。可以用水作为制备的阴性对照、�/span>

6、用自选方法纯� N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠� 20次免 RNA提取的核酸释放剂试用装、�/span>

三、设� RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进�?

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标� N+9� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标� N+4� PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用� PCR阴性对�?用水做模�?�?个用� PCR阳性对�?用第 4号阳性对照稀释液做模�?。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变、�/span>

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)９�/span>

成分	N+2个制备所得样�?/span>	qRT-PCR阴性对�?/span>	qRT-PCR阳性对�?2-7�?
2×qRT-PCR缓冲涱�/span>	10μL	10μL	� 10μL
非洲马瘟病毒染料法qRT-PCR引物混合�?/span>	2μL	2μL	� 2μL

50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	� 0.4μL
样品制备所� RNA模板(来于� 8�?	5.6μL	-	-
稀释所� 6个阳性对�?来于� 6�?	-	-	� 5.6μL(2号样� 2号管�?号样� 3号管�?
超纯氳�/span>	-	5.6μL	-
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

�?需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000�?300�?700�?900HT� Step-One、Step-One Plus、�/span>

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500�?500Fast、MJ Research� Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000、�/span>

不需要使� ROX的机� � Thermal Cycle Dice Real Time System � LightCycler � Smart Cycler System � Agilent Mx3000P � RotorGene 3000、RotorGene 6000、�/span>

9、上机后按下面参数进� RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)、�/span>

过程	温度	时间
RT(逆转�?	50ℂ�/span>	15-30 min
预变�?/span>	95ℂ�/span>	5 min
qRT - PCR反应(40个循�?	95ℂ�/span>	15 sec
qRT - PCR反应(40个循�?	58ℂ�/span>	1 min(采集 FAM通道的荧光信�?
按仪器预设程序进行溶解曲线分枏�/span>

四、数据处琅�/span>

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度� log值，再推算出其浓度、�/span>

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对� Ct必须大于或等� 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等� 40则为阴性，如果小于或等� 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性、�/span>