产品及特炸�/span>

无色杆菌�?Achromobacter spp.)是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一种共生细菌，该细菌通过与其共生的线虫携带，无色杆菌有多种方式可以侵入寄主昆虫，在这个过程中，共生细菌在其中也起了很关键的作用，细菌在虫体内大量繁殖，分解其中的营养物质，并产生一些抑菌物质，减少其它微生物的污染，因此快速检测无色杆菌属通用具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测无色杆菌属通用的试剂盒，它具有下列特点９�/span>

1、即开即用，用户只需要提供DNA模板、�/span>

2、特异性高，引物是根据人无色杆菌属通用高度保守区设�?不会扩增其他细菌、�/span>

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR�?00倍、�/span>

4、提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品、�/span>

5、一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染、�/span>

6、本产品只能用于科研，本试剂盒足�?0�?0μL体系的PCR、�/span>

规格及成刅�/span>

成分	编号	十孔盒包裄�/span>
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(棕色)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(亮黄�?
无色杆菌属通用PCR引物混合涱�/span>	14-17600yw	100μL(白盖)
无色杆菌属通用PCR阳性对�?/span>(1×108拷贝/μL)	14-17600pc	50 μL(红盖)
核酸释放剂试用装	61202	20�?1mL，绿�?
使用手册	14-17600sc	1仼�/span>

运输及保字�/strong>

低温运输�?20℃保存，保存期限�?2个月、�/span>

自备试剂

样品DNA、�/span>

使用方法

一、制备标准曲线样�?�?0²-10⁷拷贝/μL�?�?0倍稀释度为例)、�/span>

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成�?。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照、�/span>

1、标�?个离心管，分别为7�?�?�?�?�?、�/span>

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液�?*用带芯枪头，下同)、�/span>

3、在7号管中加�? μL阳性对�?其浓度为1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震�?分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

4、换枪头，在6号管中加�? μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震�?分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

5、换枪头，在5号管中加�? μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对�?上步稀释所�?，充分震�?分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用、�/span>

二、样品DNA的制夆�/span>

7、用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容、�/span>

8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠�?0次免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤、�/span>

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进�?

9、如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，�?个标准曲线样品只选一个做(可以�?号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置、�/span>

10、在标记管中按下表加入各成分９�/span>

成分	N+2�?/strong> 样品箠�/strong>	PCR阴性对照管	标准曲线 样品�?2-7�?
2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	�?0μL
无色杆菌属通用PCR引物混合涱�/span>	2 μL	2 μL	�? μL
自备10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	�? μL
N+2个待测样品DNA模板	6 μL	不加	不加
自备超纯氳�/span>	不加	6 μL	不加
�?步所得标准曲线样品稀释液(2-7�?	不加	不加	�?μL(2号样�?号管�?号样�?号管�?

�?仅ABI7500�?700�?900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代、�/span>

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优�?、�/span>

四、荧光定量PCR反应参数

过程	温度	时间
预变�?/span>	94ℂ�/span>	5 min
PCR反应 (40个循�?	94ℂ�/span>	0.5 min
	50ℂ�/span>	0.5 min(采集SYBR通道的荧光信�?
	72ℂ�/span>	0.5 min
最后延伷�/span>	72ℂ�/span>	10 min

五、数据处琅�/span>

12、设�?0�?96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性、�/span>

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度、�/span>

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等�?0。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等�?0则为阴性，如果小于或等�?5则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性、�/span>