HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中�?*个关键酶，催化葡萄糖转化�?-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点、�/span>

HK催化葡萄糖合�?-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催�?-磷酸葡萄糖脱氢生成NADpH，NADpH�?40nm有特征吸收峰、�/span>

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测、�/span>

产品组成９�/strong>

产品名称	规格	保存条件
提取涱�/span>	液体100ml×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂一	液体20ml×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂事�/span>	粉剂×1瓵�/span>	2-8ℂ�/span>
试剂丈�/span>	粉剂×2�?/span>	-20ℂ�/span>

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加�?8ml试剂一充分溶解，置�?7�?哺乳动物)�?5�?其它物种)水浴5min；用不完的试�?℃保存一周；

2.试剂三：临用前取1支加�?.5 ml试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周、�/span>

自备材料９�/strong>

紫外分光光度�?酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV�?、研�?匀浆器、冰、�/span>

操作步骤 (仅供参�? ９�/strong>

一、样本处�?可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文�?

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104�?：提取液体积(ml)�?00�?000�?的比�?建议500万细菌或细胞加入1ml提取�?，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功�?0%�?00W，超�?s，间�?0s，重�?0�?�?000g 4℃离�?0min，取上清，置冰上待测、�/span>

组织：按照组织质�?g)：提取液体积(ml)�?�?�?0的比�?建议称取�?.1g组织，加�?ml提取�?，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离�?0min，取上清，置冰上待测、�/span>

血�?�?样本：直接检测、�/span>

二、测定步骣�/span>

1.分光光度计或酶标仪预�?0min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零、�/span>

2.在微量石英比色皿�?6孔板中加�?80μL试剂二�?0μL试剂三和10μL样本，混匀，立即记�?40nm�?0秒时的吸光值A1，比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放�?7�?哺乳动物)�?5�?其它物种)水浴或恒温箱中，准确反应5分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5�?0秒时的吸光度A2，计� ΔA=A2-A1、�/span>

三�?strong>HK活性计箖�/span>

A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.血�?�?HK活性单位的定义：每毫升血�?�?在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/ml)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷V样÷T=643×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活�?/span>

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生�?nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义：每g组织每分钟生�?nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样�?÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义：�?万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位� HK(U/10⁴cell)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样�?÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADpH摩尔消光系数�?.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径�?cm；V样：加入样本体积�?.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度� mg/ml；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万、�/span>

B、用96孔板测定的计算公式如上�/span>

1.血�?�?HK活性单位的定义：每毫升血�?�?在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/ml)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷V样÷T=1071.7×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活�?/span>

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生�?nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1071.7×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义：每g组织每分钟生�?nmol的NADpH定义为一个酶活力单位、�/span>

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样�?÷T=1071.7×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义：�?万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位� HK(U/10⁴cell)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样�?÷T=2.143×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADpH摩尔消光系数�?.22×10³L/mol/cm；d�?6孔板光径�?.6cm� V样：加入样本体积�?.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度� mg/ml；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万、�/span>

注意事项９�/strong>

1.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量�?7℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放�?7℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中、�/span>

2.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性、�/span>

3.不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请�?-2次预试验，若ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数)，或缩短反应时间�?min，使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度、�/span>