正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体� MDH� TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆� MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为 NAD-依赖� MDH� NADP-依赖� MDH，细菌中通常只含� NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中、�/span>

测定原理９�/span>

MDHm催化 NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm处光吸收下降、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器�? mL石英比色皿和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制９�/span>

试剂一：液� 50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1mL×1支，-20℃保存；

试剂四、液� 50 mL×1瓶，� 4℃保存；

试剂五、粉剂�?支，-20℃保存；临用前加� 300μL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

试剂六、粉剂�?支，-20℃保存；临用前加� 300μL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

样本测定的准备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离９�/span>

①称取约 0.1g组织或收� 500万细胞，加入 1mL试剂一� 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆、�/span>

②将匀浆液� 600g�?℃离� 5min、�/span>

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中�?1000g�?℃离� 10min、�/span>

④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏� MDH(此步可选做)、�/span>

⑤在步骤④中的沉淀中加� 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3秒，间隔 10秒，重复 30�?，用于线粒体 MDH测定、�/span>

测定步骤９�/span>

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/span>

2、将试剂四在 37�?哺乳动物)� 25�?其它物种)水浴 10min以上、�/span>

3、操作表９�/span>

试剂名称(μL)	测定孓�/span>
样本	20
试剂囚�/span>	760
试剂亓�/span>	10
试剂�?/span>	10

将上述试剂按顺序加入 1 mL石英比色皿中，混匀后立即在 340 nm波长下记录初始吸光度A1和反� 1min后的吸光� A2，计� ΔA=A1-A2。计算公式中乘以相应稀释倍数、�/span>

MDHm活力单位的计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：� mg组织蛋白每分钟消� 1 nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：� g组织每分钟消� 1 nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

MDHm(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样�?÷T =1299×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/span>

单位的定义：� 1万个细菌或细胞每分钟消� 1 nmol� NADH定义为一个酶活力单位、�/span>

MDHm(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总�?ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样�?÷T=0.65×ΔA

V反总：反应体系总体积，8×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径�?cm；V样：加入样本体积�?.02mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL� T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL�?000：细胞或细菌总数�?000万、�/span>