正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

丙酮酸磷酸双激�?pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1)� C4 途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催� ATP、丙酮酸� Pi 经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于 C4 植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用、�/span>

测定原理９�/span>

PPDK 的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP � PPi 生成丙酮酸、ATP � Pi，乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸� NADH 生成乳酸� NAD+，在 340nm 测定 NADH 减少速率，计算PPDK 活性、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器�?mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制９�/span>

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液� 60 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

试剂� ：液� 60μL×1 支，4℃保存；体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用、�/span>

样本的前处理９�/span>

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0 的比�?建议称取� 0.1g 组织，加� 1mL提取�?，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

测定步骤和加样表９�/span>

1� 分光光度计预� 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/span>

2� 样本测定

(1)工作液的配制：临用前取试剂二一瓶加�25mL试剂一�12.5μL试剂三，充分混匀，置� 37℃水� 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融、�/span>

(2)� 1mL 石英比色皿中加入50μL样本�950μL工作液，混匀，立即记� 340nm 处初始吸光� A1 � 37℃反� 5min 后的吸光� A2，计� ΔA=A1-A2、�/span>

PPDK 活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计箖�/span>

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消� 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/span>

PPDK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/span>

单位定义：每 g 组织每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/span>

PPDK(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样�?÷T=643×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：NADH 摩尔消光系数�?.22×10³L/ mol/cm；d� 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积�?.05mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T� 反应时间�? min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g、�/span>