正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/strong>

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体� MDH � TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆� MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢� 苹果�?天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖� MDH � NADP-依赖� MDH� NADP-MDH 主要存在于真核细胞中、�/p>

测定原理９�/strong>

NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降、�/p>

需自备的仪器和用品９�/strong>

紫外分光光度�?酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水、�/p>

试剂的组成和配制９�/strong>

试剂一、提取液 100 mL×1 瓶，� 4℃保存；

试剂二、液� 20 mL×1 瓶，� 4℃保存；

试剂三、粉剂�? 瓶，-20℃保存；

样本测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴�?：试剂一体积(mL)� 500�?000�? 的比�?建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一)，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3s，间� 10s，重� 30 �?�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

组织：按照组织质�?g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0 的比�?建议称取� 0.1g 组织� 加入 1mL 试剂一)，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

2、血�?�?样品：直接检测、�/p>

测定步骤９�/strong>

1� 分光光度计或酶标仪预� 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/p>

2、检测工作液的配制：用时在试剂三中加� 19mL 试剂二和 0.5mL 蒸馏水，充分混匀待用� 用不完的试剂分装�?20℃保存，禁止反复冻融：�/p>

3、测定前将检测工作液� 37�?哺乳动物)� 25�?其它物种)水浴 10min 以上、�/p>

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加� 5μL 样本� 195μL 工作液，混匀后立即记� 340nm� 20s 时的吸光� A1 � 1min20s 后的吸光� A2，计� ΔA=A1-A2、�/p>

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，� A1-A2 小于 0.5，可提高检测灵敏度、�/p>

计算公式中乘以相应稀释倍数、�/p>NADP-MDH 活力单位的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如上�/strong>

1、血�?�?NADP-MDH 活力的计箖�/p>

单位的定义：每毫升血�?�?每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=6430×ΔA

2、组织、细菌或细胞� NADP-MDH 活力的计箖�

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：� mg 组织蛋白每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：� g 组织每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样�?÷T=6430×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/p>

单位的定义：� 1 万个细菌或细胞每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位� NADP-MDH(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总�?00)÷T=12.86×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADPH 摩尔消光系数�?.22×10³L / mol /cm；d� 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积�?.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T� 反应时间�? min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL�?00：细胞或细菌总数�?00 万、�/p>b.� 96 孔板测定的计算公式如上�/strong>

1、血�?�?NADP-MDH 活力的计箖�/p>

单位的定义：每毫升血�?�?每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=12860×ΔA

2、组织、细菌或细胞� NADP-MDH 活力的计箖�

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：� mg 组织蛋白每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：� g 组织每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位、�/p>

NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样�?÷T=12860×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/p>

单位的定义：� 1 万个细菌或细胞每分钟消� 1 nmol � NADPH 定义为一个酶活力单位� NADP-MDH(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样�?÷T=25.72×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADPH 摩尔消光系数�?.22×10³L / mol /cm；d�?6 孔板光径�?.5cm；V 样：加入样本体积�?.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL� T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL�?00：细胞或细菌总数�?00 万、�/p>