注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定、�/strong>

测定意义９�/strong>

L-半乳糖途径是合� AsA 的主要途径。Gal LDH 位于线粒体内膜，负责催化植物体内 AsA 生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内 AsA 含量的积累起着至关� 要的作用、�/p>

测定原理９�/strong>

Gal LDH 催化 L-半乳糖内酯还原细胞色� c(Cyt c)，还原型 Cyt c � 550nm 有吸收峰；测 定还原型 Cyt c 增加速率，来计算 Gal LDH 活性、�/p>

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计�?mL 玻璃比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水、�/p>

试剂组成和配制：

试剂一：液� 50mL×1 瓶，4℃保存、�/p>

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 40mL 蒸馏水，充分溶解、�/p>

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水，充分溶解、�/p>

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)� 1�?�?0 的比�?建议称取� 0.1g 组织，加� 1mL试剂一)进行冰浴匀浆�?3000g�?℃离� 10min，取上清置冰上待测、�/p>Gal LDH 测定操作９�/strong>

1. 分光光度计预� 30 min，调节波长到 550nm，蒸馏水调零、�/p>

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预� 30 min、�/p>

3. 依次� 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 上清液�?00μL 预热的试剂二� 100μL 试剂三，� 速混匀后于 550nm 比色，记� 10s � 130s 的吸光� A1 � A2，△A = A2﹣A1、�/p>Gal LDH 活性计算公式：

(1). 按蛋白浓度计箖�/p>

Gal LDH 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原 1μmol Cyt c � 1 个酶活单位、�/p>

Gal LDH (μmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总�?0⁶÷(Cpr×V �?÷T=289×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计箖�/p>

Gal LDH 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还� 1μmol Cyt c � 1 个酶活单位、�/p>

Gal LDH (μmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总�?0⁶÷(W×V 样÷V 样�?÷T=289×△A ÷W

ε：还原型 Cyt c 摩尔消光系数�?7.3×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径(cm)�?cm；V 反总：� 应体系总体积，1mL=0.001 L�?06�?mol=1×106μmol；V 样：加入反应体系中上清液体积�?00μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反� 时间�?min、�/p>

注意事项:

试剂二和试剂三配制好� 3 天内使用完、�/p>