意义：线粒体转氢�?2 (Mitochondrial hydrogenase-2, TH-2) 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催� NADH+ NADP+ � NAD++ NADPH 相互转化，调节线粒体 NAD(H) � NADP(H) 平衡� 把逆向反应称为 TH-2，催� NADPH � NAD+ 生成 NADP+ � NADH、�/p>

原理：NADH � NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导� 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷�?APAD+)替代 NAD+，TH-2 催化 APAD+ 还原生成 APADH，APADH � 375nm 有特征光吸收，测� 375nm 光吸收的增加速率，来� � TH-2 活性、�/p>

检测方法：分光光度泔�/strong>

产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
AK256-A	50 mL×1 瓵�/p>	-20℃保存；
AK256-B	25 mL×1 瓵�/p>	-20℃保存；
AK256-C	25 mL×2 瓵�/p>	4℃保存、�/p>
AK256-D	粉剂×2 �?/p>	-20℃保存；
AK256-E	粉剂×2 �?/p>	-20℃保存；

� 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定、�/p>

自备用品９�/strong>

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器�?mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水、�/p>

样品的制备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离

1. 准确称取 0.1g 组织或收� 500 万细胞，加入 1mL AK256-A，用冰浴匀浆器或研钵匀浆、�/p>

2. 将匀浆液 600g�?℃离� 5min、�/p>

3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中�?1000g�?℃离� 10min、�/p>

4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)、�/p>

5. 步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL AK256-B，超声波破碎(冰浴，功� 20% � 200W� 超声 3s，间� 10 秒，重复 30 �?，用� TH-2 活性测定、�/p>

测定步骤９�/strong>

1. 分光光度�?酶标仪预� 30 min 以上，调节波长到 375 nm，蒸馏水调零、�/p>

2. 工作液的配制：临用前� AK256-C、D、E 各一支，� AK256-D、E 转移� AK256-C 中混合溶 解，置于 37�?哺乳动物)� 25�?其它物种)水浴 5min；现配现用；

3. � 1mL 玻璃比色皿中按顺序加入下列试剁�/p>

试剂名称	测定� (μL)
样品	100
工作涱�/p>	1000
混匀，立即记� 375 nm 处初始吸光� A1 � 10min 后的吸光� A2，计箖�/p> ΔA=A2-A1、�/p>

TH-2 含量计算公式９�/strong>

(1)按样本鲜重计箖�/p>

单位的定义：每g 组织每分钟产�? nmol APADH 定义为一个酶活性单位、�/p>

TH-2 活� (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样�? ÷T = 82×ΔA÷W

(2)按样本蛋白浓度计箖�/p>

单位的定义：� mg 组织蛋白每分钟产� 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位、�/p>

TH-2 活� (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T = 164×ΔA÷Cpr

� 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：�? 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位、�/p>

TH-2 活� (nmol/min /10⁴cell) = [ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样�? ÷T = 0.164×ΔA

注： V 反总：反应体系总体积，1.1×10^-3L；ε：APADH 摩尔消光系数�?.7×10³L / mol /cm；d� 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积�?.1mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T� 反应时间�?0 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞 总数�?00 万、�/p>