β葡萄糖醛酸苷酶βGD微量法检测试剂盒操作步骤９�/strong>

1. 样品的准备：

a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4 ℃或冰浴预冷的PBS 或生理盐水洗�?-2遍。沉淀用预冷组织细胞裂解液4 ℃或冰浴匀�? 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品、�/p>

b. 组织样品的准备：动物用生理盐�?0.9% NaCl ，含�?.16mg/ml肝素�? 灌流血液后获取组织样品。按照每100mg加入500-1000ul组织细胞裂解液比例， 4 ℃或冰浴匀�? 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4 ℃离心，取上清作为待测样品、�/p>

d. 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（P1511）测定蛋白浓度。通常10-20ug蛋白的细胞或组织匀浆液样品中SOD平均活力�?个活力单位左�?不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参�? 。每种样品准�?0-100 ug蛋白量通常已经足够用于后续检测、�/p>

e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏通常需要稀�?0-100 倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-70 ℃冻存，但建议尽量当天完成测定、�/p>

2. 试剂盒的准备工作９�/p>

a. WST-8酶工作液的配制： 参照下表，根据待检测样�?包括标准�? 数量，配制适量WST-8酶工作液，配制好的WST-8酶工作液4 ℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用、�/p>

注意：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用、�/p>

b. 反应启动工作液配制：将试剂盒提供的反应启动液 (40X) 溶解后混匀，按1μl 反应启动�?40X) 加入39μl SOD 检测缓冲液的比例进行稀释，即为反应启动工作液�?℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用、�/p>

c. (可选做) SOD 标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度�?0U/ml�?0U/ml �?U/ml�?.5U/ml�?.25U/ml�?.625U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：为避免稀释后SOD酶活性的下降� SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考、�/p>

3. 样品测定９�/p>

a. 参考下表使�?6孔板加入各个组分，注意设置样品孔和各种空白对照孔、�/p>

注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差、�/p>

b. 37℃孵�?0分钟、�/p>

说明：孵�?5�?5分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为检测结果的一致性，推荐孵育30分钟、�/p>

c. 450nm 测定吸光度。如�?50nm 滤光片，可以使用420-480nm 的滤光片。也可以使用大于600nm 的波长作为参考波长进行双波长测定、�/p>

4. 样品中总SOD活力的计算：

a. 百分率的计算９�/p>

参考如下计算公式计算百分率９�/p>

百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)�?A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%

如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为９�/p>

百分率＝(A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%

如果计算出来的百分率小于30% 或大�?0% ，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的百分率�?0-70%范围内。如果测定出来的百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的百分率偏低，则需重新准备浓度较高的待测样品、�/p>

b. SOD酶活力单位的定义：在上述化酶藕联反应体系中百分率�?0% 时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位 (unit)。注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换算、�/p>