半岛bd体育手机客户端 介绍
半岛bd体育手机客户端 及特点 拟杆菌属(Bacteroides)是指革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌。又称类杆菌属。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。本半岛bd体育手机客户端 就是以染料法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测拟杆菌属的通用试剂盒,它具有下列特点: 1、即开即用,用户只需要提供样品 DNA模板。 2、引物等组分经过优化,灵敏度高。 3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。 4、特异性高,引物是根据拟杆菌属 DNA高度保守区设计,不会跟其他微生物的 DNA发生交叉反应。 5、既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。 6、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的染料法荧光定量 PCR反应。 7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。 规格及成分
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。 自备试剂 样品 DNA。 使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E1-106拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。 1、标记 6个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。 2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同。 3、在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5、换枪头,在 4号管中加入 5 μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品 DNA的制备 7、如果有 N个样品待提取,**设置 N+2个提取,多出的是 PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 10000倍稀释液 10μL再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另外用水作为 NC。 8、用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。三、SYBR qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 9、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
注:个别 qPCR半岛游戏平台官网入口网址 型号需要添加 ROX染料校正,以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据。该试剂盒成分已包含 ROX染料 II,需 ROX染料 II的机型不需要额外添加。 需使用 ROX染料 I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus,建议终浓度 500nM。 需使用 ROX染料 II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000,建议终浓度 50nM。 11、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
四、数据处理 12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值,再推算出其浓度。 13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于 30。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于 29。对待测样品,如果其 Ct≥30则为阴性,如果≤29则为阳性。如果在 29-30之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果≥30则为阴性,如果小于 30,则为阳性。熔解曲线也须一并考虑,如果熔解 Tm值与目的扩增片段 Tm特征值相差≥2℃,则为非特异性扩增,不是真正的阳性扩增。 |
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