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PCR/RT-PCR >> PCR试剂盒
灭鲑气单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒
灭鲑气单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Aeromonas salmonicida Probe qPCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

灭鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是气单胞菌属(Aeromonas)细菌的一个种 ,是引起鲑鳟鱼类疖疮病及溃疡病的最主要病原菌,给鲑科 (Salmonidae)鱼类养殖带来严重损失。近年来研究表明,该菌宿主范围逐渐扩大,可感染除了鲑科外的其他水产动物,如刺参、斑点叉尾鲙、乌鳢和大菱鲆等。对灭鲑气单胞菌的检测主要依赖于传统的微生物分离培养鉴定方法,其操作过程费时、繁琐,且很难得到准确结果,常常延误病情的诊断,而且对于已感染该菌但尚未发病的鱼类,通过常规分离鉴定方法很难得到准确结果。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测灭鲑气单胞菌的试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化,灵敏性高。

3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4、特异性高,引物是根据灭鲑气单胞菌高度保守区设计,不会跟其他病原 DNA发生交叉反应。

5.本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6.本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分 编号 十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix 190303 500 μL(本色盖)
荧光 PCR专用模板稀释液 180701 1 mL(黄盖)
灭鲑气单胞菌探针法 qPCR引物混合液 15-25330yw 100 μL(白盖)
灭鲑气单胞菌 qPCR探针 15-25330pb 50 μL(棕色管)
灭鲑气单胞菌探针法 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL) 60908-25330pc 50 μL(黄盖)
使用手册 15-25330sc 1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品,**设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分 样品管N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线样品管(2-7管)
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
灭鲑气单胞菌 qPCR探针 1 μL 1 μL 各 1 μL
灭鲑气单胞菌探针法 qPCR引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2个待测 DNA模板 7 μL - -
超纯水 - 7 μL -
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) - - 各 7 μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程 温度 时间
预变性 95℃ 3 min
PCR反应(40个循环) 95℃ 15sec
PCR反应(40个循环) 60℃ 1 min(采集 FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 40则为阴性,如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间,则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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