荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。本文就对几种常用的荧光剂进行了具体的介绍。

免疫荧光 (IF)

在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。

免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。

在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记(一抗)。第二种抗体本身就携带荧光染料(二抗)，并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料，下文均有提及。

FITC 和 TRITC

异硫氰酸荧光素(FITC) 是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在 495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。而它的基本成分—— 荧光素，其摩尔质量为 332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成 Alexa Fluor?488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。

经常与 FITC 同时使用的另一种染料是与其相似的TRITC [四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸]。与 FITC 相反，TRITC 并非荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统，正是该系统引发了它们的荧光行为。还有一点与FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由最大波长为 550nm的绿色光谱中的光所激发，它的最大发射波长为 573 nm。与蛋白质(例如，抗体)结合也基于异硫氰酸盐反应基团。

虽然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠，因此，在最新的显微镜技术中并不推荐。

青色素

这类荧光染料相对较少，从青色素衍生而来，也是其名称的由来：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸或蛋白相连。例如，采用了蛋白标记的马来酰亚胺基团。有趣的是，对于荧光，Cy5 对其周边电子环境非常敏感，该特征可用于酶测定。附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外，Cy3 和 Cy5 还可用于 FRET 试验。青色素染料是一种相对较老的荧光染料，但却是其他荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善的基础。

Alexa Fluor?染料

Alexa Fluor?染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列，该系列染料囊括范围较广，且经常用于荧光显微镜技术之中。这些染料的名称是由其发明者Richard Paul Haugland 以他儿子 Alex Haugland 的名字命名的。该半岛bd体育手机客户端 标识是 Molecular Probes(美国生命科学技术公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收购)的商标。此外，这些半岛bd体育手机客户端 标识中也涵盖了相应的激光激发波长。例如，应用范围很广且最大激发波长为 493 nm的Alexa Fluor?488，可由标准的488 nm激光激发。Alexa Fluor?488的最大发射波长为 519 nm，正是因为具备上述特性，使得 Alexa Fluor?488与 FITC 的属性相似。尽管 Alexa Fluor?488是一种荧光素衍生物，但与 FITC 相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor? 染料(比如，Alexa Fluor?546、Alexa Fluor?633)都是不同基础荧光物质的磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青色素或罗丹明，它们的摩尔质量在410 至 1400 g/mol 范围之内。

DNA 染色

在荧光显微镜技术中，不只研究蛋白结构，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位置及其数量。最常用的一种DNA 染色剂当属 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可与DNA 双螺旋的 A-T 富集区域相结合。如果 DAPI 附着到 DNA 上，其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受最大波长为358 nm的紫外光激发，其发射光谱非常宽，在461 nm 处达到峰值。此外，还可对弱荧光进行 RNA 结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。

第二种被广泛使用的DNA 染色剂就是 Hoechst 染料系列，这些染料原先都是由 Hoechst AG 这家化学公司生产的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均为双苯酰亚胺，可嵌入 A-T 富集区域，因此，该系列染料很少用到。与 DAPI 相似，这三种染色剂都可受最大发射波长为455 nm的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其最大发射波长在 510–540 nm 之间。Hoechst 染色剂还具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或已固定的细胞中。该染色剂与DAPI 的不同之处在于，它们的毒性较低。

碘化丙啶(Propidium-Iodide，PI)是一种不能透过细胞膜的 DNA 染色剂。由于具备上述特性，该染色剂无法进入完整的细胞中，因此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入剂，但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。该染色剂与核酸结合后，最大激发波长为538 nm，最大发射波长为 617 nm。未结合 PI 的最大激发和发射波长和光强会更低一些。PI 还可结合 RNA，同时无需改变自身的荧光特性。有时候为了区分DNA 和 RNA，有必要使用适当的核酸酶。

不需要前期处理，吖啶橙就可以鉴别DNA 与 RNA 。吖啶橙与 DNA 结合后，最大激发/发射波长为 502 nm/525 nm，而与 RNA 结合后，最大激发/发射波长为460 nm/650 nm。此外，它还能够进入溶酶体等酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，吖啶橙由蓝色光谱中的光激发，但发射波长在橙色区域达到最大。由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室，因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。

区室和细胞器特异性染料

在荧光显微镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此，该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。

观察线粒体最常用的方法就是利用 MitoTracker?，它是一种可透过细胞的染料，包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应，从而与基质蛋白实现共价结合。MitoTracker? 有不同的颜色和修饰类型(参见表 1)，此外，它还是 Molecular Probes 的商标。与罗丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同，在用固定剂破坏膜电位后，MitoTracker?不会被洗掉。

依据线粒体染色剂，还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室，这类染料被称为LysoTracker。它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成，具有膜穿透性。最有可能的情况是，这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择(参见表 1)。

与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡，这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述区室，则要使用FM 4-64?或FM 5-95?等苯乙烯基染料。

对于蛋白质分泌实验，内质网 (ER) 具有重要的研究意义。对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6(3)。该染料虽然偏好 ER，但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对ER 进行特异性染色的另一种方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的两种染料，其与格列本脲(一种磺酰基脲酶)连接，并可与仅存于内质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。BODIPY(硼-二吡咯亚甲基，boron-dipyrromethene)是一种几乎不溶于水的、对pH 相对不敏感的染料基团，该染料对蛋白质标记没太大用处，但却是脂质和膜标记的良好工具。

对于与ER相邻的高尔基体，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。 上述神经酰胺为鞘脂类，其在高尔基体中高度富集。

借助基于脂质的染料，可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以观察胆固醇富集区域(Avanti Polar Lipids)。

除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外，还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。这些蛋白质可以和荧光染料相连，并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素(WGA) 可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合，将WGA 与荧光染料偶联，这样我们就可以观察到细胞质膜了。

离子成像

在有关神经元方面的研究中，观察基因活性或细胞运动等对于了解细胞的离子浓度具有重要意义。钠、钙、氯或镁离子对很多不同的细胞活动都具有较大影响。一般情况下，借助荧光标记的螯合剂可将离子困住，螯合剂在结合相应离子后会改变离子的光谱特性。例如，利用该原理的钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。

对于钠离子的检测，通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以检测钾离子。

有趣的是，还存在以蛋白质为主的钙指示剂，其中一种是基于水母化学发光蛋白—水母素。水母素、发光体腔肠素、分子氧和 Ca2+的相互作用会释放蓝光，这是在荧光蛋白质的发现过程中非常著名的机制。

荧光染料及其激发和发射波长峰值

上文提到的所有染料在下表中均有统计。此外，还涵盖了其他荧光染料及其激发和发射波长峰值。

荧光染料示例	激发光
Indo-1, Ca saturated	331 nm
Indo-1 Ca2+	346 nm
Cascade Blue BSA pH 7.0	401 nm
Cascade Blue	398 nm
LysoTracker Blue	373 nm
Alexa 405	401 nm
LysoSensor Blue pH 5.0	374 nm
LysoSensor Blue	374 nm
DyLight 405	399 nm
DyLight 350	332 nm
BFP (Blue Fluorescent Protein)	380 nm
Alexa 350	343 nm
7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0	346 nm
Amino Coumarin	345 nm
AMCA conjugate	347 nm
Coumarin	360 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin	360 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0	361 nm
6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0	358 nm
Hoechst 33342	352 nm
Pacific Blue	404 nm
Hoechst 33258	352 nm
Hoechst 33258-DNA	352 nm
Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0	404 nm
PO-PRO-1	434 nm
PO-PRO-1-DNA	435 nm
POPO-1	433 nm
POPO-1-DNA	433 nm
DAPI-DNA	359 nm
DAPI	358 nm
Marina Blue	362 nm
SYTOX Blue-DNA	445 nm
CFP (Cyan Fluorescent Protein)	434 nm
eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)	437 nm
1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)	375 nm
Indo-1, Ca free	346 nm
1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)	375 nm
BO-PRO-1-DNA	462 nm
BOPRO-1	462 nm
BOBO-1-DNA	461 nm
SYTO 45-DNA	451 nm
evoglow-Pp1	448 nm
evoglow-Bs1	448 nm
evoglow-Bs2	448 nm
Auramine O	431 nm
DiO	487 nm
LysoSensor Green pH 5.0	447 nm
Cy 2	489 nm
LysoSensor Green	447 nm
Fura-2, high Ca	336 nm
Fura-2 Ca2+sup>	336 nm
SYTO 13-DNA	488 nm
YO-PRO-1-DNA	491 nm
YOYO-1-DNA	491 nm
eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)	488 nm
LysoTracker Green	503 nm
GFP (S65T)	489 nm
BODIPY FL, MeOH	502 nm
Sapphire	396 nm
BODIPY FL conjugate	503 nm
MitoTracker Green	490 nm
MitoTracker Green FM, MeOH	490 nm
Fluorescein 0.1 M NaOH	493 nm
Calcein pH 9.0	494 nm
Fluorescein pH 9.0	490 nm
Calcein	493 nm
Fura-2, no Ca	367 nm
Fluo-4	494 nm
FDA	495 nm
DTAF	495 nm
Fluorescein	495 nm
Fluorescein antibody conjugate pH 8.0	493 nm
CFDA	495 nm
FITC	495 nm
Alexa Fluor 488 hydrazide-water	493 nm
DyLight 488	493 nm
5-FAM pH 9.0	492 nm
FITC antibody conjugate pH 8.0	495 nm
Alexa 488	493 nm
Rhodamine 110	497 nm
Rhodamine 110 pH 7.0	497 nm
Acridine Orange	431 nm
Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0	499 nm
BCECF pH 5.5	485 nm
PicoGreendsDNA quantitation reagent	502 nm
SYBR Green I	498 nm
Rhodaminen Green pH 7.0	497 nm
CyQUANT GR-DNA	502 nm
NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA	497 nm
DansylCadaverine	335 nm
Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0	499 nm
Fluoro-Emerald	495 nm
Nissl	497 nm
Fluorescein dextran pH 8.0	501 nm
Rhodamine Green	497 nm
5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0	504 nm
DansylCadaverine, MeOH	335 nm
eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)	514 nm
Oregon Green 488	498 nm
Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0	498 nm
Fluo-3	506 nm
BCECF pH 9.0	501 nm
SBFI-Na+	336 nm
Fluo-3 Ca2+	506 nm
Rhodamine 123, MeOH	507 nm
FlAsH	509 nm
Calcium Green-1 Ca2+	506 nm
Magnesium Green	507 nm
DM-NERF pH 4.0	493 nm
Calcium Green	506 nm
Citrine	515 nm
LysoSensor Yellow pH 9.0	335 nm
TO-PRO-1-DNA	515 nm
Magnesium Green Mg2+	507 nm
Sodium Green Na+	507 nm
TOTO-1-DNA	514 nm
Oregon Green 514	512 nm
Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0	513 nm
NBD-X	466 nm
DM-NERF pH 7.0	509 nm
NBD-X, MeOH	467 nm
CI-NERF pH 6.0	513 nm
Alexa 430	431 nm
Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2	431 nm
CI-NERF pH 2.5	504 nm
Lucifer Yellow, CH	428 nm
LysoSensor Yellow pH 3.0	389 nm
6-TET, SE pH 9.0	521 nm
Eosin antibody conjugate pH 8.0	525 nm
Eosin	524 nm
6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0	526 nm
6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride	525 nm
Bodipy R6G SE	528 nm
BODIPY R6G, MeOH	528 nm
6 JOE	520 nm
Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0	399 nm
Cascade Yellow	399 nm
mBanana	540 nm
Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2	528 nm
Alexa 532	528 nm
Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0	533 nm
6-HEX, SE pH 9.0	534 nm
mOrange	548 nm
mHoneydew	478 nm
Cy 3	549 nm
Rhodamine B	543 nm
DiI	551 nm
5-TAMRA-MeOH	543 nm
Alexa 555	553 nm
Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2	553 nm
DyLight 549	555 nm
BODIPY TMR-X, SE	544 nm
BODIPY TMR-X, MeOH	544 nm
PO-PRO-3-DNA	539 nm
PO-PRO-3	539 nm
Rhodamine	551 nm
Bodipy TMR-X conjugate	544 nm
POPO-3	533 nm
Alexa 546	562 nm
BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2	544 nm
Calcium Orange Ca2+	549 nm
TRITC	550 nm
Calcium Orange	549 nm
Rhodaminephalloidin pH 7.0	558 nm
MitoTracker Orange	551 nm
MitoTracker Orange, MeOH	551 nm
Phycoerythrin	565 nm
Magnesium Orange	550 nm
R-Phycoerythrin pH 7.5	565 nm
5-TAMRA pH 7.0	553 nm
5-TAMRA	549 nm
Rhod-2	552 nm
FM 1-43	472 nm
Rhod-2 Ca2+	553 nm
Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0	552 nm
FM 1-43 lipid	473 nm
LOLO-1-DNA	568 nm
dTomato	554 nm
DsRed	563 nm
Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide	372 nm
Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0	555 nm
Fluor-Ruby	554 nm
Resorufin	571 nm
Resorufin pH 9.0	571 nm
mTangerine	568 nm
LysoTracker Red	578 nm
Lissaminerhodamine	572 nm
Cy 3.5	578 nm
Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0	573 nm
Sulforhodamine 101, EtOH	578 nm
JC-1 pH 8.2	593 nm
JC-1	592 nm
mStrawberry	575 nm
MitoTracker Red	578 nm
MitoTracker Red, MeOH	578 nm
X-Rhod-1 Ca2+	580 nm
Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2	579 nm
Alexa 568	576 nm
5-ROX pH 7.0	578 nm
5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)	578 nm
BO-PRO-3-DNA	574 nm
BOPRO-3	574 nm
BOBO-3-DNA	570 nm
Ethidium Bromide	524 nm
ReAsH	597 nm
Calcium Crimson	589 nm
Calcium Crimson Ca2+	590 nm
mRFP	585 nm
mCherry	587 nm
Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2	596 nm
HcRed	590 nm
DyLight 594	592 nm
Ethidium homodimer-1-DNA	528 nm
Ethidiumhomodimer	528 nm
Propidium Iodide	538 nm
SYPRO Ruby	467 nm
Propidium Iodide-DNA	538 nm
Alexa 594	590 nm
BODIPY TR-X, SE	588 nm
BODIPY TR-X, MeOH	588 nm
BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0	590 nm
Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2	567 nm
YO-PRO-3-DNA	613 nm
Di-8 ANEPPS	469 nm
Di-8-ANEPPS-lipid	469 nm
YOYO-3-DNA	612 nm
Nile Red-lipid	553 nm
Nile Red	559 nm
DyLight 633	624 nm
mPlum	587 nm
TO-PRO-3-DNA	642 nm
DDAO pH 9.0	648 nm
Fura Red, high Ca	434 nm
Allophycocyanin pH 7.5	651 nm
APC (allophycocyanin)	650 nm
Nile Blue, EtOH	631 nm
TOTO-3-DNA	642 nm
Cy 5	646 nm
BODIPY 650/665-X, MeOH	646 nm
Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2	569 nm
DyLight 649	652 nm
Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2	653 nm
Alexa 647	653 nm
Fura Red Ca2+	435 nm
Atto 647	644 nm
Fura Red, low Ca	472 nm
Carboxynaphthofluorescein pH 10.0	600 nm
Alexa 660	664 nm
Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2	663 nm
Cy 5.5	673 nm
Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2	679 nm
Alexa 680	679 nm
DyLight 680	678 nm
Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2	696 nm
Alexa 700	696 nm
FM 4-64, 2% CHAPS	506 nm
FM 4-64	508 nm