试剂 半岛游戏平台官网入口网址 设备 原料
银牌会员第 5
访问量: 2360968 网址:hydranal.cnreagent.com 在线留言
半岛bd体育手机客户端 搜索
检测试剂盒 >> 生化试剂盒
NAD/NADH定量试剂盒
NAD/NADH定量试剂盒图片
货号: AK300
包装: 50T/24S
索取资料及报价
货号: AK300
半岛bd体育手机客户端 别名: NAD(H) Quantification Assay Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

意义:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种参与多种氧化还原反应的酶辅因子(辅酶Ⅰ)。NAD 作 为电子载体,在氧化态(NAD)和还原态(NADH)之间循环。除了在氧化还原反应中的作用外,NAD 在 ADP 核糖基化反应中起着关键作用,并且是 sirtuins 的底物。辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生 物和培养细胞中。NAD 参与细胞物质代谢、能量合成、细胞 DNA 修复等多种生理活动,对机体免疫能力 有重要作用。NADH 在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说 明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。

原理:分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原 氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一 步采用 MTT 还原法检测,通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H)的含量。

检测方法:分光光度法

半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件:

编号

规格

储存条件

酸性提取液

25mL×1 瓶

4℃保存;

碱性提取液

25mL×1 瓶

4℃保存;

AK300-A

15 mL×1 瓶

4℃保存;

AK300-B

4 mL×1 瓶

4℃保存;

AK300-C

粉剂×1 瓶

-20℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水,混匀,剩余试剂 4℃

保存一周;

AK300-D

粉剂×1 瓶

4℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水,混匀,剩余试剂 4℃保

存一周;

AK300-E

1.8mL×1 支

4℃保存;

AK300-F

30mL×1 瓶

4℃保存;

AK300-G

50mL×1 瓶

4℃保存;

NAD 标准品

粉剂×1 支

-20℃保存,临用前加入 1.5 mL 蒸馏水,即 2 μmol/mL,

将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用;

NADH 标准品

粉剂×1 支

-20℃保存,临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 2 μmol/mL,

将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

NAD+ 和 NADH 的提取:

1. 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取:

(1)NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

(2)NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2. 组织中 NAD+和 NADH 的提取:

(1)NAD+ 的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴 中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

(2)NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴 中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3. 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:

(1)NAD+ 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸 性 提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液), 超声波破碎 1min(冰浴,强度 20%或 200W,超声 2s,停 1s),95℃水浴 5min(盖紧,以防 止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取 液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

(2)NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱 性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液), 超声波破碎 1min(冰浴,强度 20%或 200W,超声 2s,停 1s),95℃水浴 5min(盖紧,以防 止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取 液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。

2. 在1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加入下列试剂

试剂名称

对照管 (μL)

测定管 (μL)

NAD 或 NADH 标准管(μL)

空白管 (μL)

样本

50

50



标准品



50


蒸馏水




50

AK300-A

250

250

250

250

AK300-B

75

75

75

75

AK300-C

75

75

75

75

AK300-D

75

75

75

75

AK300-E

35

35

35

35

AK300-F

500

混匀,室温避光静置20min

AK300-F


500

500

500

充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

AK300-G

1000

1000

1000

1000

混匀,570nm 下比色,读取吸光值 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,NAD 标准管的记为 ΔA标准 1=A 标准管 1-A 空白管。NADH 标准管的记为 ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。

(空白管只需做 1-2 次)

注意事项:

1. 对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须马上加 AK300-F;测定管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须反应 20min 后再加 AK300-F。

2. 操作及反应过程中注意避光。

3. 由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 50 管保证测 24 个 NAD+ 或 NADH。

NAD+和 NADH 含量的计算:

(一) NAD+含量的计算:

1. 血清(浆)中 NAD+含量计算

NAD+含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

2. 组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (nmol/mg prot) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 ÷ Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷W= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (nmol/104cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

(二) NADH 含量的计算:

1. 血清(浆)中 NADH 含量计算

NADH 含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

2. 组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA

标准 2 ÷ Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷W=2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/104cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

注:C 标:NAD 或 NADH 标准溶液的浓度 1.25nmol/mL;V 提取:加入提取液总体积,1mL;2:提取过程中上清液稀释倍数; V 血清:提取时加入的血清体积,0.1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:500 万个细胞。

相关半岛bd体育手机客户端
我要咨询 关闭
  • 姓名*
  • 电话*
  • 单位*
  • email
  • 留言内容*
  • 验证码*
  • 让更多商家关注
  • Baidu
    map