半岛bd体育手机客户端 介绍
意义:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种参与多种氧化还原反应的酶辅因子(辅酶Ⅰ)。NAD 作 为电子载体,在氧化态(NAD)和还原态(NADH)之间循环。除了在氧化还原反应中的作用外,NAD 在 ADP 核糖基化反应中起着关键作用,并且是 sirtuins 的底物。辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生 物和培养细胞中。NAD 参与细胞物质代谢、能量合成、细胞 DNA 修复等多种生理活动,对机体免疫能力 有重要作用。NADH 在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说 明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。 原理:分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原 氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一 步采用 MTT 还原法检测,通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H)的含量。 检测方法:分光光度法 半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件:
※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 自备用品: 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 NAD+ 和 NADH 的提取:1. 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取: (1)NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 (2)NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2. 组织中 NAD+和 NADH 的提取: (1)NAD+ 的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴 中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 (2)NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴 中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 3. 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取: (1)NAD+ 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸 性 提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液), 超声波破碎 1min(冰浴,强度 20%或 200W,超声 2s,停 1s),95℃水浴 5min(盖紧,以防 止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取 液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 (2)NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱 性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液), 超声波破碎 1min(冰浴,强度 20%或 200W,超声 2s,停 1s),95℃水浴 5min(盖紧,以防 止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取 液使之中和,混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤: 1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。 2. 在1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加入下列试剂
注意事项: 1. 对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须马上加 AK300-F;测定管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须反应 20min 后再加 AK300-F。 2. 操作及反应过程中注意避光。 3. 由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 50 管保证测 24 个 NAD+ 或 NADH。 NAD+和 NADH 含量的计算:(一) NAD+含量的计算: 1. 血清(浆)中 NAD+含量计算 NAD+含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 2. 组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NAD+ (nmol/mg prot) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 ÷ Cpr (2)按样本鲜重计算 NAD+ (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷W= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W (3)按细菌或细胞密度计算 NAD+ (nmol/104cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 (二) NADH 含量的计算: 1. 血清(浆)中 NADH 含量计算 NADH 含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 2. 组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 ÷ Cpr (2)按样本鲜重计算 NADH (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷W=2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W (3)按细菌或细胞密度计算 NADH (nmol/104cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 注:C 标:NAD 或 NADH 标准溶液的浓度 1.25nmol/mL;V 提取:加入提取液总体积,1mL;2:提取过程中上清液稀释倍数; V 血清:提取时加入的血清体积,0.1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:500 万个细胞。 |
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